基本介紹
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4. 靶基因序列的選擇
大部分反義核酸是在胞漿內與靶基因序列作用而形成雜交複合體的，所以靶基因（mRNA）中二級結構少或無的區域，也就是mRNA啟動子周圍的序列，是反義核酸的理想作用位點。對於核內的mRNA，參與其加工和外運的序列以及剪接位點處的序列是有效的靶基因序列。另外，5’-帽端是多數起動子的結合位點，也是有效的靶基因區。
5. 反義核酸的化學修飾
反義技術的一個重大挑戰是寡聚核苷酸的穩定性，因為未經修飾的寡聚核苷酸在生物體內會被核酸酶迅速降解。反義實驗中套用到大量的化學修飾的核苷酸。一般來說，核苷酸的修飾分為三類：非天然鹼基的類似物、經過修飾的糖（尤其是核糖的2'位置）、改變的磷酸骨架。
硫代磷酸酯寡聚脫氧核糖核酸（Phosphorothioate DNA Oligonucleotides，PS DNA ON）是第一代DNA類似物的主要代表，被認為是至今為止了解最多和套用最廣泛的反義寡聚核苷酸。在這一類寡聚核苷酸中，磷酸二酯鍵中的非橋氧原子被置換成硫原子。PS DNA ON的主要缺點是能與一些蛋白結合，這可以引起細胞毒性。但從藥物動力學角度來看卻是有利的。與血漿蛋白的結合可以保護它們免遭過濾，使得它們在血清中的半衰期延長。PS DNA ON的另外一個缺點是與互補RNA的親和性會稍微降低與硫代磷酸酯寡聚脫氧核苷酸相關的問題在第二代寡聚核苷酸中得到一定程度的解決。第二代寡聚核苷酸在核糖的2'位置含有烷基修飾。2'-O-甲基和2'-O-乙基是這類修飾的兩個重要成員。具有這種修飾的寡聚核苷酸比硫代磷酸酯DNA的毒性低，並且與互補RNA的親和性也得到了稍微提高。然而這些有利的性質被2'-O-烷基RNA不能激活RNaseH切割靶RNA這個缺點所抵消。
最近幾年，有多種經過修飾的核酸被開發，用於提高靶標親和性、核酸酶抗性和藥物動力學性質。“構像限制”的概念被廣泛用於提高親和性和生物穩定性。這些新類型的核酸被歸為“第三代”反義試劑。
6. 反義核酸導入體內的載體
為提高反義核酸的局部轉染率，使其最大量地進入細胞內，可通過一定運載系統將外源反義核酸通過上述方法轉移至局部細胞。常用載體有：
（1） 脂質體：將反義核酸的負電荷包裹後形成更易穿過細胞膜的脂溶性複合體，可明顯提高細胞的攝取能力，常用的脂質體為陽離子脂質體，如DOTMA和DOTAP。
（2）病毒脂質體運載系統：可明顯提高轉染率 。
（3）病毒：主要有逆轉錄病毒和腺病毒，前者主要作用於增生期細胞，轉染率低，但與宿主細胞核的整合能力強，整合後穩定性強，可持續表達五個月以上；後者研究較多的是複製缺陷腺病毒，可作用於增殖期和靜止期細胞，轉染率高，但整合能力和穩定性均較低，其細胞毒性和免疫反應及感染生殖腺細胞限制了其在體內的套用。
（4）其它：如受體介導等，套用尚不廣泛。
7. 反義核酸的吸收與分布
反義核酸的吸收取決於其序列長度、荷電量、水/脂溶性及其濃度。螢光吖啶標記的未修飾的核酸是通過受體介導的細胞內吞作用進入細胞內的，且已分離出分子量分別為34KD和80KD的兩種膜表面蛋白。對於修飾過的反義核酸，其主要吸收機制有所不同，但多數細胞表現為溫度及能量依賴性的細胞顆粒內吞作用，37℃時吸收量最大。核素及螢光標記的反義核酸在大多數細胞中先以顆粒形式內化（Internalization）於內吞小泡中，後期可達細胞核內。
8. 反義核酸的作用機制
反義寡核苷酸抑制靶基因表達的確切機制尚不完全清楚。一般認為有特異性和非特異性機制兩種。
特異性機制是指反義寡核苷酸與靶序列結合後通過以下途徑抑制靶基因的表達：
（1）與DNA結合成三鏈結構或與單鏈DNA結合成雙鏈結構以阻止靶基因的複製或轉錄；
（2）與靶mRNA結合形成雙鏈雜交體激活核酸酶H，裂解靶mRNA阻斷蛋白質的翻譯；
（3）與mRNA AP位點結合干擾其剪接、加工和運輸以終止蛋白質的翻譯；
（4）占據酶結合位點，表達核酶，降解靶mRNA。
非特異性機制指非序列特異性藥理學效應，或與細胞蛋白間反應，為許多雙鏈核酸所共有，如雙鏈RNA（dsRNA）增加IFN的合成，激活兩種IFN誘導基因：2’，5’-寡腺苷酸合成酶（2’，5’-AS）和蛋白激酶P60。前者激活核酸內切酶RnaseL降解靶mRNA，後者使真核細胞起始因子2（CIF-2）的α亞單位磷酸化導致啟動mRNA的翻譯失敗，從而抑制蛋白質的合成。dsRNA尚能活化腺苷酸環化酶使cAMP濃度升高。另外，尚有dsRNA誘導內皮細胞IL-1α表達的報導。
當然，反義寡核苷酸的非特異性效應有可能導致細胞毒性。體外大多數細胞能耐受100μmol/L濃度的反義寡核苷酸。
9. 反義核酸的毒副作用
反義核酸的細胞毒作用與核酸的化學修飾基因、序列長度及作用濃度和時間有關。一般而言，核酸序列愈長、作用濃度愈大、時間愈久，毒性作用愈大。有關反義核酸在體內的毒性研究較少，靜脈或腹腔注射硫代磷酸核苷酸後，在體內迅速再分布，T1/2≈10-60分鐘，主要經過尿液排泄，清除時間較長，約20-40小時，這表明可以不必大量反覆用藥即可使靶組織中具有一定治療濃度的反義核酸。然而，反義核苷酸可在如心、胃、腸等臟器中明顯聚集，這些非靶器官中集聚的反義核酸可產生非特異性地蛋白合成抑制作用，尤其是對骨髓和小腸等增生旺盛的器官；同時寡核苷酸降解後剩餘的化學修飾鹼基有摻合入DNA而引起突變或干擾DNA修復的可能。而局部套用反義核苷酸可明顯減少其對遠處組織的毒性作用。
