原位雜交組織化學技術

原位雜交組織化學技術(in situ hybridization histochemistry；ISHH) 簡稱原位雜交，是一種在組織細胞原位進行的核酸分子雜交技術，敏感度高，特異性強，是當前分子生物學研究的重要手段。

基本介紹

• 中文名：原位雜交組織化學技術
• 外文名：in situ hybridization histochemistry
• 簡稱：原位雜交
• 特點：敏感度高，特異性強

一、技術原理

原位雜交技術是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過鹼基互補規則與組織細胞內待測的核酸復性結合而使得組織細胞中的特異性核酸得到定位，並通過探針上所標記的檢測系統將其在核酸的原有位置上顯示出來。

經特定標記的核苷酸鏈為探針，可與組織切片、細胞或染色體標本中的待檢DNA片段或mRNA進行雜交，然後顯示標記物，從而分析待檢核酸的分布和含量。利用此項技術可研究各種基因在染色體上的定位，編碼某種蛋白質的mRNA在胞質中的表達。

二、核酸探針的套用

（一）探針的分類

1.按所帶標記物，探針可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。目前，大多數放射性標記法是通過酶促反應將標記的基因摻入DNA中，常用的同位素標記物有3H、35S和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高，背景較為清晰等優點，但是由於放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和螢光素三種。

2.按核酸不同性質，探針又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。cDNA探針又可分為雙鏈cDNA探針和單鏈cDNA探針。

（二）探針的選擇

根據不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個鹼基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針、RNA探針或寡核苷酸探針。

長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測複雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜於組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內或核內。

（三）探針的標記

在選擇探針類型的同時，還需要選擇標記方法。探針的標記方法很多，選擇什麼標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定。但在選擇標記方法時，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。

三、原位雜交技術的基本方法

原位雜交技術方法大致可分為：1.雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；2.雜交；3.雜交後處理；4.顯示（visualization）：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。

（一）固定

原位雜交組織化學技術在固定劑的套用和選擇上應兼顧到三個方面：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；使探針易於進入細胞或組織。DNA是比較穩定的，mRNA是相對穩定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。

因此，對於DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度並不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材後應儘快予以冷凍或固定。

（二）玻片和組織切片的處理

1．玻片的處理

玻片包括蓋片和載片套用熱肥皂刷洗，自來水清洗乾淨後，置於清潔液中浸泡24h，清水洗淨烘乾，95%酒精中浸泡24h後蒸餾水沖洗、烘乾，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。由於ISHH的實驗周期長，實驗程式繁雜，因此，要套用粘附劑預先塗抹在玻片上，乾燥後待切片時套用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，多聚賴氨酸液。

2．增強組織的通透性和核酸探針的穿透性

此步驟根據套用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由於其與蛋白質產生廣泛的交叉連線就需要套用較強的增強組織通透性的試劑。增強組織通透性常用的方法如套用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和澱粉酶（diastase）等。

這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存最和影響組織結構的形態，因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。

3．減低背景染色

在原位雜交實驗程式中，如何減低背景染色是一個重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素造成的。雜交後（Posthybridization）的酶處理和雜交後的洗滌均有助於減低背景染色。

預雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區別在於前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。

4．防止RNA酶的污染

由於在手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應於實驗前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。雜交前及雜交時所套用的溶液均需經高壓消毒處理。

（三）雜交（Hybridisation）

在ISHH，整個實驗周期是比較長的，實驗程式也比較繁雜，而雜交在ISHH整個實驗中可被認為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此，雜交是ISHH中關鍵的而且是最重要的一個環節。

雜交是將雜交液滴於切片組織上，加蓋矽化的蓋玻片，防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導致雜交液的蒸發。為保證雜交所需的濕潤環境，可將其放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑膠盒中進行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同，所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖。

（四）雜交後處理

（post hybridisation treatment）

雜交後處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。通過雜交後的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。

（五）顯示（Visualization）

根據核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統進行不同顯色處理。細胞或組織的原位雜交切片在顯示後均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀（computer-assisted image analysis）檢測銀粒的數量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統顯色，然後利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數量的核酸的顯色強度進行檢測。

（六）對照實驗和ISHH結果的判斷

和其它實驗方法一樣，必須同時設對照試驗以證明其實驗結果特異性。對照試驗的設定須根據核酸探針和靶核苷酸的種類和現有的可能條件去選定。

ISHH的最大優點是它的高度特異性，它可測定組織、培養的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。套用高敏感度的放射性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mRNA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。由於雙鏈DNA的穩定性，在用ISHH定位DNA時很少發生丟失，降解，其敏感性高到能夠顯示在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。

正因為如此，對ISHH結果的解釋應持慎重態度，特別是前人未報告過的新發現。