《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》是深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司於2014年5月29日申請的發明專利，該專利申請號為2014102326566，公布號為CN104031201A，公布日為2014年9月10日，發明人是饒微、杜凱、趙莉。
《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》提供的製備方法，通過配製並使用適宜的乳化液對磁性微球基體進行處理，並通過乳液聚合實現對磁性微球基體表面的修飾，從而獲得一種表面包覆有聚丙烯酸酯類聚合物層的磁性微球。其中，所述乳化液包括以下組分：丙烯酸單酯類化合物、丙烯酸二醇酯類化合物、引發劑以及任選地陰離子表面活性劑和水。當用於生物蛋白分離時，該磁性微球在不影響與特定蛋白的連線能力的前提下，顯著減少了與其它蛋白的非特異性吸附，為實現高的蛋白特異性吸附的分離工程提供了新的選擇。
2021年6月24日，《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用
- 申請人：深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司
- 發明人：饒微、杜凱、趙莉
- 申請號：2014102326566
- 申請日：2014年5月29日
- 公布號：CN104031201A
- 公布日：2014年9月10日
- 地址：廣東省深圳市南山區藝園路200號A座3樓
- 代理機構：北京聿宏智慧財產權代理有限公司
- 代理人：吳大建、鐘日紅
- Int. Cl.：C08F220/14、C08F222/14、C08F220/28、C08F220/18、C08F2/26、C08F2/44、C07K1/22、G01N33/53、G01N33/577
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,技術領域,權利要求,實施方式,專利榮譽,
專利背景
磁性納米粒子（例如Fe3O4納米粒子）既具有納米材料所特有的性質，如粒徑小、比表面大、偶聯容量高等，又具有磁回響性及超順磁性，可以在恆定磁場下聚集和定位、在交變磁場下吸收電磁波產生熱，此外磁性納米粒子還可以通過表面改性而帶有多種活性功能基團（如-OH、-COOH、-NH3等）。因此，磁性納米粒子在例如生物分離、藥物釋放、高熱法制癌症等生物醫藥領域具有廣闊的套用前景，從而受到了廣泛關注。
在生物和醫藥領域中，磁性微球通常指磁性高分子微球，其是一種近幾年發展起來的磁性材料，一般是採用將磁性無機粒子（例如Fe3O4等）與有機高分子材料相結合形成具有磁性的複合微球。2014年5月前已有磁性微球通過其表面改性等方式即可達到賦予其表面多種功能基的目的，從而其已被廣泛運用到生物學、細胞學和分離工程等領域中。特別是在生物分離純化、免疫分析、以及生物檢測等領域，顯示出磁性微球使用方便、快捷、高效等特點。
用於生物分離的磁性微球通常需要具備以下幾個性質：（1）超順磁性；（2）粒徑均一；（3）在水相中分散性好；（4）非特異性吸附低；（5）具有可供修飾的表面化學基團。磁性微球在蛋白質分離方面也具有明顯的優點：磁分離技術可用於大規模操作；分離過程可以直接在含有懸浮的固體粒子或另外的生物粒子的原始樣品中進行；分離過程簡單迅速。
然而，蛋白質在磁性微球表面上的非特異性吸附是採用磁性微球進行生物分離中的一個致命的事件，不僅會降低微球的特異性分離效果，而且在檢疫測定中會增加背景信號，降低信噪比。通常，阻止蛋白對磁性納米粒子或磁性微球的非特異性吸附的策略是對其表面進行化學修飾。
專利文獻CN102746529A公開了一種乳液聚合製備單分散磁性微球的方法，但是該方法製備的磁性微球對蛋白質的非特異性吸附高，在免疫檢測中的性噪比不佳，且成本較高，不利於工業化生產。
專利文獻CN92105584.6公開了一種通過懸浮聚合製備免疫磁性微球的方法，在該方法中，將γ-Fe2O3或Fe3O4磁粉表面用長鏈脂肪酸進行改性處理，然後在苯乙烯溶液中進行懸浮聚合，得到免疫磁性微球。該方法製備的磁性微球雖然成本低，但是對蛋白質的非特異性吸附也較高，而且在水中分散性不佳。
王羽等人採用多孔γ-Fe2O3@SiO2磁性矽膠作為基質，首先環氧基修飾，然後採用粒徑約為50微米聚合物酸將外表面的環氧基先開環形成二醇基，然後再以十八胺、亞硫酸氫鈉及三乙胺鹽酸鹽分別與內表面殘餘的環氧基進行反應，最終得到內表面依次為十八烷基、磺酸基和季銨鹽基而外表面為二醇基的新型磁性限進材料（王羽，基於磁性微球限進功能化的新型生物樣品預處理技術[D]，天津大學，2012年）。該材料外表面的二醇基可以起到排阻蛋白的作用，而且內表面為磺酸基和季銨鹽基的磁性限進材料對小分子物質的吸附量要遠遠高於內表面為十八烷基的材料。然而，該論文中公開的磁性微球的製備工藝較為複雜，其對生物蛋白的特異性分離效果還有待進一步考究。
發明內容
專利目的
《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》的目的是提供一種磁性微球，該磁性微球能夠用於生物蛋白的分離並顯著地減少或避免蛋白非特異性吸附。
《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》的另一個重要的目的是提供如上所述的磁性微球的製備方法。在該方法中，該發明的發明人基於大量的研究和試驗，選擇合適的乳化液組分及其含量，結合具有磁性的基體，從而在不影響連線特定蛋白的同時又獲得能夠減少或避免與其它蛋白發生非特異性吸附的磁性微球。
此外，《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》還提供了如上所述的磁性微球在免疫檢測方面的套用。
技術方案
《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》提供了一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法，包括以下步驟：步驟a）：製備乳化液；步驟b）：將具有磁性的磁性微球基體分散於所述乳化液中，得到分散體系；步驟c）：將所述分散體系進行聚合反應；其中，所述磁性微球基體為經過表面修飾使其表面帶有活性基團的磁性微粒；所述乳化液包括以下組分：丙烯酸單酯類化合物、丙烯酸二醇酯類化合物和引發劑。所述引發劑優選為水溶性引發劑。其中，丙烯酸單酯類化合物充當聚合單體，丙烯酸二醇酯類化合物起到交聯劑的作用。在上述方法中所使用的磁性微球基體經改性處理後獲得特定種類的官能團，且在引發劑的作用下丙烯酸單酯類和交聯劑能夠發生交聯聚合而包覆在磁性微球基體表面，從而得到所述磁性微球。與2014年5月前已有技術不同，該發明採用上述乳化液對磁性微球基體進行修飾並不是為了引入活性基團，同時通過聚合物承載所述活性基團，而是在磁性微球基體已帶有活性基團的基礎上，通過特定的乳化液乳化聚合形成的聚合物層對磁性微球基體作進一步的修飾改性，從而使磁性微球在不影響通過活性基團特異性連線特定蛋白（例如抗原）的情況下，還可以減少或避免與其它蛋白的非特異性吸附。該發明的技術原理可以通過以下說明進行解釋，但這並不能構成對該發明的限定。通過該發明提供的方法製備得到的包覆聚丙烯酸酯類聚合物的磁性微球，其表面的空洞、凹陷等缺陷得到填補（而這些空洞、凹陷等缺陷正是使得具有一定形狀（例如Y形）的干擾抗體被非特異性吸附的重要原因），表面更為光滑，因此對其它蛋白的非特異性吸附大為減少。
在一個優選的實施方案中，所述乳化液還包括陰離子表面活性劑和水。丙烯酸單酯類化合物與丙烯酸二醇酯類化合物疏水性強，而磁性微球基體的親水性好，這樣磁性微球與丙烯酸單酯類化合物與丙烯酸二醇酯類化合物得不到充分的接觸，當加入水溶性好的表面活性劑時，不僅有利於使磁性微球分散性更好，而且使得聚合物易於吸附到磁性微球基體表面進行聚合，通過對磁性微球基體的包覆，也彌補了微球表面的某些物理缺陷。
在該發明的一些實施方案中，所述乳化液包括基於乳化劑總重量計為0.5-30重量百分比的丙烯酸單酯類化合物、0.05-5重量百分比的丙烯酸二醇酯類化合物、0.2-2重量百分比的水溶性引發劑、0.1-1重量百分比的水溶性陰離子表面活性劑，以及62-99重量百分比的水。其中，丙烯酸單酯類化合物的含量優選為0.1-15重量百分比，還優選為2-10％。丙烯酸二醇酯類化合物的含量優選為0.1-2％。其中，所述丙烯酸單酯類化合物的量進一步優選為0.5-20重量百分比，還優選為2-15重量百分比。此外，應理解，如上所述“丙烯酸單酯類化合物”不限於單一化合物，可以是丙烯酸單酯類化合物的任意混合物。上述“丙烯酸二醇酯類化合物”等組分與此類似。另外，上述各化合物的特定種類與含量不可單獨看待，應從整體上考慮，通過乳化液各成分及其特定含量的協同作用，使得乳化液對修飾磁球表面效果達到最佳。例如，丙烯酸二醇酯類化合物含量低於0.05％時，與單體的交聯聚合反應不佳，導致對磁球的表面修飾效果不理想，最終達不到該發明提高信噪比的技術效果；而當其含量過高，餘量的丙烯酸二醇酯類化合物可能與磁性微球基體上的活性基團作用，降低後期磁性微球與抗原蛋白連線的能力，更不利於檢測。同樣，對丙烯酸單酯類化合物含量的限定原因亦如上所述。在該發明中，通過選擇這樣的乳化液配方，經乳液聚合之後，在磁性微球基體的表面形成聚合物層，該聚合物層既不影響磁性微球與特定蛋白（通過活性基團）的連線能力，同時又能減少該磁性微球與其它蛋白的非特異性作用，還能保證磁性微球的物化性能的穩定性。這些有益效果例如可以從下面的實施例得到驗證。
在該發明的一些優選實施方案中，為了獲得合適厚度的聚合層以及最佳化聚合反應，使得交聯劑與單體協同增效且不帶來副產物，從而更好地保持磁性微球活性基團與特定蛋白的連線能力，同時減少磁性微球與其它蛋白的非特異性吸附，丙烯酸二醇酯類化合物的重量含量為丙烯酸單醇酯類化合物的重量含量的5-15％，還優選為10％。
適用於該發明的丙烯酸單酯類化合物包括但不限於甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸羥丁酯。適用於該發明的丙烯酸二醇酯類化合物包括但不限於乙二醇二甲基丙烯酸酯、1，3-丙二醇二甲基丙烯酸酯、1，3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1，4-丁二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯、和1，6-己二醇二甲基丙烯酸酯。適用於該發明的水溶性引發劑包括但不限於過硫酸鈉、過硫酸鉀和過硫酸胺；適用於該發明的陰離子表面活性劑包括但不限於十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十六烷基磺酸鈉和正癸基硫酸鈉。所使用的水優選為純化水。
在該發明中，為了不影響磁性微球與後期特定蛋白的連線能力的同時減少該磁性微球與其它蛋白的非特異性吸附作用，且不影響磁性微球本身的物化性能，例如磁性、水相中的分散性等，該發明通過使乳化液中的丙烯酸酯類化合物和丙烯酸二醇酯類化合物發生交聯聚合反應，從而最終在磁性微球基體表面形成表面包覆聚丙烯酸酯類聚合物層的磁性微球。而磁性微球在既不影響與特定蛋白連線的同時又需要減少後續與其它蛋白的非特異性吸附的情況下，就需要在丙烯酸酯類化合物和丙烯酸二醇酯類化合物發生交聯聚合反應之前對磁性微球基體進行表面引入活性基團。所述活性基團能與生物蛋白鍵合。所述活性基團例如為巰基、羥基、羧基、氨基、環氧基、醛基、異氰酸酯基、氰酸酯基、氰基、異氰基、烯丙基、苄基、丙烯基、馬來醯亞胺基、N-羥基琥珀醯亞胺酯基、羰基、酚羥基、磺酸基、肟基（包括醛肟、酮肟等）、偶氮基、異氰基、腙基以及上述所有官能團的衍生基團。該發明所使用的磁性微球基體可以是根據已知的方法對未修飾的磁性微粒進行表面改性而獲得，也可以通過直接購買獲得。所述未修飾的磁性微粒例如可以是γ-Fe2O3，MeFe2O3（Me＝Co、Mn、Ni），Fe3O4，Ni、Co、Fe、Fe-Co和Ni-Fe合金等納米粒子，優選為γFe2O3和/或Fe3O4納米粒子。合適的磁性微球基體例如可以是Dynabeads（挪威Dynal公司生產）、Estapor微球（貨號M1-070/60，Merck公司生產）、Sera-Mag磁珠（貨號2415-2105-050250，Thermo Scientific公司生產）或Dynabeads磁珠（貨號M-280，Life Technologies公司生產）等。
該發明所使用的磁性微球基體的粒徑大小優選為0.1-5微米。在這個粒徑範圍的磁性微球基體既在水相中具有良好的分散性，又保證了較大的比表面積。磁性微球基體可以是實心的或空心的，還可以是多孔的。磁性微球基體的形狀優選為球形。球形的磁性微球基體，其表面積大，吸附效果最佳。
在分散體系中，磁性微球基體的濃度太大容易產生聚集沉澱，濃度太小則乳化聚合效果不佳、生產效率低。因此，該發明的發明人經過大量實驗後，將分散體系中的磁性微球基體濃度選擇為10-400毫克/毫升，並優選為10-200毫克/毫升，還優選為10-150毫克/毫升，進一步優選為20-100毫克/毫升。在該濃度範圍中，磁性微球基體能夠在分散體系中均勻穩定地分散，又能獲得較佳的聚合效果。
為保證包覆在磁性微球基體表面的聚丙烯酸酯類聚合物層具有合適的厚度，且對磁性微球基體表面修飾效果最佳，所述方法的步驟c）中的聚合反應優選在60-90攝氏度，更優選在70-75攝氏度下進行；還優選在攪拌下進行聚合反應10-40小時，更優選為15-30小時。
在一個實施方案中，該發明的方法還包括步驟c）之後的步驟d）：將步驟c）得到的產物進行固液分離，洗滌固體，得到所述磁性微球。
在一些具體實施方案中，在步驟a）中，將所述乳化液的組分相互混勻來製備所述乳化液，例如通過攪拌或超聲使乳化液的固體組分溶解，並任選地採用均質化處理（例如採用高壓勻質機、高剪下乳化劑等進行均質化），使乳化液的組分相互充分混勻得到乳化液；在步驟b）中，通過超聲使磁性微球基體分散於所述乳化液中；在步驟d）中，所述固液分離採用磁分離或離心；所述洗滌依次以有機溶劑和水洗滌數次；所述有機溶劑選自醇類（例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇等）、酯類（例如乙酸乙酯、乙酸丁酯等）和鹵代烴中的一種或多種。
該發明還提供了一種根據如上所述的方法製備得到的磁性微球，其包括具有磁性的磁性微球基體和包覆所述磁性微球基體的聚丙烯酸酯類。聚丙烯酸酯類材料的包覆能夠彌補磁性微球基體表面的某些缺陷，從而減少後續的非特異性吸附，但不影響蛋白的連線能力。
在該發明的磁性微球中，表面包覆的聚丙烯酸酯類聚合物的厚度尤為重要，厚度太大則容易將磁性微球基體表面的活性基團遮蓋，從而影響其與後續的蛋白連線能力，厚度太小，則起不到對微球基體表面的物理修飾作用，從而達不到減少非特異性吸附的能力。通過該發明的發明人的大量研究，製備得到的磁性微球表面包覆的聚丙烯酸酯類厚度為0.001-5微米，優選為5納米-1000納米，還優選為10-500納米，進一步優選為10-100納米，更優選為50納米-100納米。該厚度範圍的聚丙烯酸酯類聚合物層有利於不影響後期磁性微球表面基團與特定蛋白的連線，減少或避免磁性微球與其它蛋白的非特異性吸附，以及避免影響到磁性微球本身的物化性質，例如磁性。
此外，該發明還提供了根據如上所述的方法製備得到的磁性微球在生化檢測中的套用，例如在免疫檢測，尤其是在化學發光免疫定量分析中的套用。此類套用，例如套用於人血清中各種特異性總抗體、特異性IgG、IgM類抗體的化學發光免疫檢測。
在一些具體的套用中，該發明提供的磁性微球可用於對弓形蟲IgG抗體、弓形蟲IgM抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、風疹病毒IgG抗體、風疹病毒IgM抗體、巨細胞病毒IgG抗體、巨細胞病毒IgM抗體、I/II型單純胞疹病毒IgG抗體、I/II型單純胞疹病毒IgM抗體、EB病毒IgG抗體和EB病毒IgM抗體中的至少一種的化學發光免疫定量檢測。
改善效果
《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》提供的磁性微球的製備方法，通過配製並使用適宜的乳化液對磁性微球基體進行處理，並通過乳液聚合實現對磁性微球基體表面的修飾，從而獲得一種可用於生物分離的磁性微球。當用於生物蛋白分離時，該磁性微球在不影響與特定蛋白的連線能力的前提下，顯著減少了與後續的其它蛋白的非特異性吸附，解決了生物蛋白分離中面臨的一個主要問題，為實現高的蛋白特異性吸附的分離工程提供了新的選擇。通過該方法獲得的磁性微球具有良好的分散性，其適用於大規模的操作，分離過程簡單易行。此外，該製備方法的操作步驟簡單，所採用的原料廉價易得，因此具有很大的利用價值和經濟意義。
技術領域
《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》涉及生物蛋白分離的技術領域，具體涉及一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用。
權利要求
1.一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法，包括以下步驟：步驟a）：製備乳化液；步驟b）：將具有磁性的磁性微球基體分散於所述乳化液中，得到分散體系；步驟c）：將所述分散體系進行聚合反應；其中，所述磁性微球基體為經過表面修飾使其表面帶有活性基團的磁性微粒，所述活性基團能與生物蛋白鍵合；所述乳化液包括以下組分：丙烯酸單酯類化合物、丙烯酸二醇酯類化合物和引發劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述乳化液還包括陰離子表面活性劑和水。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述乳化液包括基於乳化劑總重量計為0.5-30重量百分比的丙烯酸單酯類化合物、0.05-5重量百分比的丙烯酸二醇酯類化合物、0.2-2重量百分比的水溶性引發劑、0.1-1重量百分比的水溶性陰離子表面活性劑，以及62-99重量百分比的水。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述丙烯酸單酯類化合物選自甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸羥丁酯中的一種或多種；所述丙烯酸二醇酯類化合物選自乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,4-丁二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯和1,6-己二醇二甲基丙烯酸酯中的一種或多種；所述水溶性引發劑選自過硫酸鈉、過硫酸鉀和過硫酸胺中的一種或多種；所述陰離子表面活性劑選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十六烷基磺酸鈉和正癸基硫酸鈉中的一種或多種。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，在所述乳化液中，丙烯酸二醇酯類化合物的重量含量為丙烯酸單醇酯類化合物的重量含量的5-15％。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述丙烯酸二醇酯類化合物的重量含量為所述丙烯酸單醇酯類化合物的重量含量的10％。
7.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述活性基團選自下列組中的至少一種：巰基、羥基、羧基、氨基、環氧基、醛基、異氰酸酯基、氰酸酯基、氰基、異氰基、烯丙基、苄基、丙烯基、馬來醯亞胺基、N-羥基琥珀醯亞胺酯基、羰基、酚羥基、磺酸基、肟基、偶氮基、腙基，以及其衍生基團。
8.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述磁性微球基體的粒徑大小為0.1-5微米。
9.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述分散體系中的磁性微球基體的濃度為10-150毫克/毫升。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，步驟c）中的聚合反應在60-90攝氏度下進行；聚合反應時間為10-40小時。
11.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，在步驟a）中，將所述乳化液的組分相互混勻來製備所述乳化液；並且所述方法還包括步驟c）之後的步驟d）：將步驟c）得到的產物進行固液分離，洗滌固體，得到所述磁性微球；其中，在步驟d）中，所述固液分離採用磁分離或離心；所述洗滌依次以有機溶劑和水洗滌數次；所述有機溶劑選自醇類、酯類和鹵代烴中的一種或多種。
12.一種根據權利要求1-11中任一項所述的方法製備的磁性微球，其包括具有磁性的磁性微球基體和包覆所述磁性微球基體的聚丙烯酸酯類。
13.根據權利要求12所述的磁性微球，其特徵在於，所述聚丙烯酸酯類厚度為5納米-1000納米。
14.根據權利要求13所述的磁性微球，其特徵在於，所述聚丙烯酸酯類厚度為10納米-100納米。
15.一種根據權利要求1-11中任一項所述的方法製備的磁性微球在化學發光免疫定量分析試劑的製備中的套用。
16.根據權利要求15所述的套用，其特徵在於，所述磁性微球用於人血清中各種特異性總抗體、特異性IgG、IgM類抗體的化學發光免疫檢測。
17.根據權利要求16所述的套用，其特徵在於，所述磁性微球用於對弓形蟲IgG抗體、弓形蟲IgM抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、風疹病毒IgG抗體、風疹病毒IgM抗體、巨細胞病毒IgG抗體、巨細胞病毒IgM抗體、I/II型單純胞疹病毒IgG抗體、I/II型單純胞疹病毒IgM抗體、EB病毒IgG抗體和EB病毒IgM抗體中的至少一種的化學發光免疫定量檢測。
實施方式
實施例1
1）磁性微球基體的製備：按照中國專利CN92105584中的實施例1製備用於該實施例的帶有羧基官能團的磁性微球基體。
2）乳化液的製備：乳化液的組分及其質量百分比如下：甲基丙烯酸甲酯5%；乙二醇二甲基丙烯酸酯0.5%；過硫酸鉀0.3%；十二烷基硫酸鈉0.2%以及純化水94%。將上述各組分按比例混合，超聲處理，使其中固體組分全部溶解，然後進一步充分混勻。
3）分散體系製備：將步驟1）得到的磁性微球基體以20毫克/毫升的濃度分散於步驟2）所製備的乳化液中，並通過超聲處理，使磁性微球基體分散均勻，得到分散體系。
4）聚合反應和後處理：將步驟3）製備得到的分散體系在在75攝氏度下攪拌反應30小時，經磁鐵分離去上清液，固體用甲醇洗滌3次，水洗5次，得到磁性微球。
5）磁性微球表面活性基團連線性能的檢測
5a）檢測樣品選擇：弓形蟲IgG（TOXO IgG）陰性和陽性樣品各10例、谷氨酸脫羧酶（GAD65）陰性和陽性樣品各10例，以及巨細胞病毒IgM（CMV IgM）陰性陰性和陽性樣品各10例。以上所有樣品均經過臨床驗證確認。
5b）抗原磁性包被微球：用TOXO抗原GAD65抗原和CMV抗原包被該實施例製備得到的磁性微球，並用磷酸鹽緩衝液PBS按一定比例稀釋至工作濃度0.5毫克/毫升。
5c）發游標記物的製備：使用ABEI（N-（4-氨基丁基）-N-乙基異魯米諾）標記鼠抗人單克隆IgG抗體（anti-hIgG-ABEI）（用PBS稀釋至0.02微克/毫升）、ABEI標記葡萄球菌A蛋白（SPA-ABEI）（用PBS稀釋至0.04微克/毫升）、ABEI標記鼠抗人單克隆IgM抗體（anti-hIgM-ABEI）（用PBS稀釋至0.02微克/毫升）分別作為TOXO IgG、GAD65和CMV IgM檢測的發游標記物。
5d）加樣工藝確定：使用深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司提供的弓形蟲IgG抗體（TOXO IgG）測定試劑盒、谷氨酸脫羧酶抗體（GAD65）測定試劑盒和巨細胞病毒IgM抗體（CMV IgM）測定試劑盒，並參照相應的測試盒說明書進行加樣測定。發光信號強度採用MAGLUMI2000Plus全自動化學發光測定儀（深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司）進行測定。測定結果見表1-3。
6）磁性微球非特異吸附檢測
6a）檢測樣品選擇：正常人血清，經臨床確認TOXO IgG、GAD65和CMV IgM陰性。
6b）發游標記物的製備：使用ABEI（N-（4-氨基丁基）-N-乙基異魯米諾）標記鼠抗人單克隆IgG抗體（anti-hIgG-ABEI）（用PBS以1:4000進行稀釋）、ABEI標記葡萄球菌A蛋白（SPA-ABEI）（用PBS以1:3000進行稀釋）、ABEI標記鼠抗人單克隆IgM抗體（anti-hIgM-ABEI）（用PBS以1:4000進行稀釋）分別作為TOXO IgG、GAD65和CMV IgM檢測的發游標記物。
6c）抗原磁性包被微球：用TOXO抗原GAD65抗原和CMV抗原包被該實施例的磁性微球，並用磷酸鹽緩衝液PBS按一定比例稀釋至工作濃度0.5毫克/毫升。
6d）加樣工藝確定：使用新產業生物醫藥公司提供的弓形蟲IgG抗體（TOXO IgG）測定試劑盒、谷氨酸脫羧酶抗體（GAD65）測定試劑盒和巨細胞病毒IgM抗體（CMV IgM）測定試劑盒，並參照相應的測試盒說明書進行加樣測定。測定結果見表4。
對比例1
按照中國專利CN92105584中公開的方法製備磁性微球基體，並測定其表面活性基團連線性能和非特異吸附性能。具體測定條件和過程與實施例1中的步驟5）和步驟6）相同，不同之處在於使用該對比例製備的磁性微球基體代替實施例1步驟5）和步驟6）中的磁性微球。結果見表1-4。
測試項目 | 樣品陰性/陽性 | 血清樣品編號 | 實施例1的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 對比例1的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 |
|---|---|---|---|---|
CMV IgM | 陰性 | C336 | 5356（陰性） | 105983（陽性） |
CMV IgM | 陰性 | C128 | 1208（陰性） | 62563（陽性） |
CMV IgM | 陰性 | C500 | 4211（陰性） | 8359（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C228 | 1806（陰性） | 5698（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C86 | 2149（陰性） | 7562（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C471 | 2350（陰性） | 2359（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C60 | 4215（陰性） | 10698（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C348 | 1089（陰性） | 2439（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C502 | 4356（陰性） | 5326（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C377 | 6607（陰性） | 7659（陰性） |
CMV IgM | 陽性 | CP1 | 159563（陽性） | 165230（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP2 | 32859（陽性） | 23597（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP3 | 60538（陽性） | 53695（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP4 | 254714（陽性） | 247796（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP5 | 114689（陽性） | 120874（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP6 | 70899（陽性） | 60899（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP7 | 240563（陽性） | 257465（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP8 | 95686（陽性） | 105693（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP9 | 95631（陽性） | 75132（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP10 | 586044（陽性） | 569212（陽性） |
註：發光信號強度高於20000標記為陽性，低於20000標記為陰性，下同。
測試項目 | 樣品陰性/陽性 | 血清樣品編號 | 實施例1的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 對比例1的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 |
|---|---|---|---|---|
TOXO IgG | 陰性 | C336 | 7546（陰性） | 1168936（陽性） |
TOXO IgG | 陰性 | C348 | 5327（陰性） | 5632（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C389 | 2358（陰性） | 905326（陽性） |
TOXO IgG | 陰性 | C323 | 4781（陰性） | 5356（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C369 | 5632（陰性） | 153262（陽性） |
TOXO IgG | 陰性 | C350 | 8461（陰性） | 50329（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C377 | 2596（陰性） | 268954（陽性） |
TOXO IgG | 陰性 | C86 | 6532（陰性） | 7653（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C60 | 2579（陰性） | 4698（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C102 | 5612（陰性） | 7658（陰性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP1 | 286591（陽性） | 295336（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP2 | 168354（陽性） | 170562（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP3 | 105936（陽性） | 98653（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP4 | 468992（陽性） | 450879（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP5 | 56798（陽性） | 50598（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP6 | 136587（陽性） | 1432287（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP7 | 154805（陽性） | 168953（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP8 | 347761（陽性） | 332567（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP9 | 269547（陽性） | 254687（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP10 | 165392（陽性） | 170589（陽性） |
測試項目 | 樣品陰性/陽性 | 血清樣品編號 | 實施例1的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 對比例1的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 |
|---|---|---|---|---|
GAD65 | 陰性 | C336 | 5669（陰性） | 496652（陽性） |
GAD65 | 陰性 | C348 | 3569（陰性） | 3956（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C369 | 7452（陰性） | 6724（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C323 | 4689（陰性） | 8693（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C377 | 3569（陰性） | 2563（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C321 | 5689（陰性） | 6395（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C350 | 4567（陰性） | 7841（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C60 | 5966（陰性） | 3633（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C471 | 5368（陰性） | 5689（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C500 | 2045（陰性） | 196745（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP1 | 40569（陽性） | 36995（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP2 | 58611（陽性） | 56321（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP3 | 106335（陽性） | 86596（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP4 | 175986（陽性） | 187642（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP5 | 40539（陽性） | 46952（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP6 | 363571（陽性） | 369882（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP7 | 140266（陽性） | 132569（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP8 | 80563（陽性） | 78536（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP9 | 253658（陽性） | 265714（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP10 | 87420（陽性） | 86536（陽性） |
由以上表1-3可見，包被該發明實施例1製備的磁性微球的TOXO抗原、GAD65抗原和CMV抗原分別與相應抗體陽性的樣本中的抗體產生良好的結合，而對於相應抗體陰性的樣本，則能檢測出完全陰性的信號。這表明了實施例1製備的磁性微球的表面活性基團與蛋白、即抗原連線能力極好，磁性微球表面的聚丙烯酸酯類聚合物完全不影響磁性微球表面的活性基團與蛋白的結合。
測試項目 | 血清樣品編號 | 實施例1的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 對比例1的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 |
|---|---|---|---|
TOXO IgG | C336 | 4284（陰性） | 1224643（陽性） |
TOXO IgG | C348 | 3999（陰性） | 3792（陰性） |
TOXO IgG | C389 | 2736（陰性） | 824763（陽性） |
TOXO IgG | C323 | 5742（陰性） | 6224（陰性） |
TOXO IgG | C369 | 4840（陰性） | 123416（陽性） |
TOXO IgG | C350 | 5631（陰性） | 62498（陽性） |
TOXO IgG | C377 | 3829（陰性） | 243310（陽性） |
TOXO IgG | C86 | 8763（陰性） | 8511（陰性） |
TOXO IgG | C60 | 6012（陰性） | 5491（陰性） |
TOXO IgG | C102 | 5843（陰性） | 6161（陰性） |
GAD65 | C336 | 4464（陰性） | 628768（陽性） |
GAD65 | C348 | 3129（陰性） | 2560（陰性） |
GAD65 | C369 | 5412（陰性） | 3072（陰性） |
GAD65 | C323 | 3408（陰性） | 103748（陽性） |
GAD65 | C377 | 4012（陰性） | 3178（陰性） |
GAD65 | C321 | 3218（陰性） | 3400（陰性） |
GAD65 | C350 | 3520（陰性） | 3078（陰性） |
GAD65 | C60 | 1982（陰性） | 2634（陰性） |
GAD65 | C471 | 2561（陰性） | 22766（陽性） |
GAD65 | C500 | 2973（陰性） | 201428（陽性） |
CMV IgM | C336 | 2636（陰性） | 133538（陽性） |
CMV IgM | C128 | 2715（陰性） | 139161（陽性） |
CMV IgM | C500 | 5012（陰性） | 5843（陰性） |
CMV IgM | C228 | 1892（陰性） | 3584（陰性） |
CMV IgM | C86 | 2360（陰性） | 4509（陰性） |
CMV IgM | C471 | 1743（陰性） | 3764（陰性） |
CMV IgM | C60 | 3264（陰性） | 202597（陽性） |
CMV IgM | C348 | 3464（陰性） | 2676（陰性） |
CMV IgM | C502 | 1525（陰性） | 2127（陰性） |
CMV IgM | C377 | 3672（陰性） | 2085（陰性） |
由表4可見，該發明實施例1製備的磁性微球與樣本中的抗體的非特異性吸附性能明顯低於對比例1中未採用該發明所製備的乳化液修飾的磁性微球基體的非特異性吸附性能，而且，對於有些特殊的樣本，對比例1的測試結果更出現與臨床樣本不符合的虛高現象。以上實驗和數據表明了該發明實施例1的磁性微球具有減少或避免非特異性蛋白吸附的顯著效果。
實施例2
1）磁性微球基體的製備
按照中國專利公開CN102746529A中實施例1-6製備用於該實施例的磁性微球基體。即，首先製備聚苯乙烯聚合物種子粒子；然後使用包含聚乙烯吡咯烷酮、二乙烯基苯、苯乙烯和甲苯（成孔劑）的乳化液對該種子粒子進行修飾，經乳液聚合，得到多孔性聚苯乙烯顆粒；使用硝酸對所述多孔性聚苯乙烯顆粒進行硝化；再使用FeSO4將鐵結合至多孔性聚苯乙烯顆粒中；然後對所得顆粒進行包覆和羧基官能化之後，得到該實施例使用的帶有羧基官能團的磁性微球基體。
2）乳化液的製備
乳化液的組分及其質量百分比如下：甲基丙烯酸羥乙酯0.5%；新戊二醇二甲基丙烯酸酯0.05%；過硫酸胺0.2%；十二烷基磺酸鈉0.5%以及純化水98.75%。將上述各組分按比例混合，超聲處理，使其中固體組分全部溶解，然後進一步充分混勻。
3）分散體系製備
將步驟1）得到的磁性微球基體以40毫克/毫升的濃度分散於步驟2）所製備的乳化液中，並通過超聲處理，使磁性微球基體分散均勻，得到分散體系。
4）聚合反應和後處理
將步驟3）製備得到的分散體系在在80攝氏度下攪拌反應18小時，經磁鐵分離去上清液，固體用甲醇洗滌3次，水洗5次，得到磁性微球。
5）磁性微球表面活性基團連線性能的檢測
按照實施例1的步驟5）進行測試，不同之處在於，所使用的磁性微球替換為該實施例步驟4）製備得到的磁性微球。結果見表5～7。
6）磁性微球非特異吸附檢測
按照重複實施例1的步驟6）進行測試，不同之處在於，所使用的磁性微球替換為該實施例步驟4）製備得到的磁性微球。結果見表8。
實施例3
參照實施例2的步驟進行實驗，不同之處僅在於用以下乳化液替換實施例2中的乳化液：乳化液的組分及其質量百分比如下：甲基丙烯酸羥乙酯0.5%；新戊二醇二甲基丙烯酸酯0.2%；過硫酸胺0.2%；十二烷基磺酸鈉0.5%以及純化水98.6%。
結果見表5-8。
對比例2
按照中國專利公開CN102746529A中實施例1-4製備磁性微球基體，並測定其表面活性基團連線性能和非特異吸附性能。具體測定條件和過程與實施例2中的步驟5）和步驟6）相同，不同之處在於使用該對比例製備的磁性微球基體代替實施例2步驟5）和步驟6）中的磁性微球。結果見表5～8。
測試項目 | 樣品陰性/陽性 | 血清樣品編號 | 實施例2的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 實施例3的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 對比例2的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 |
|---|---|---|---|---|---|
CMV IgM | 陰性 | C336 | 4728（陰性） | 5044（陰性） | 987762（陽性） |
CMV IgM | 陰性 | C128 | 5689（陰性） | 5682（陰性） | 156942（陽性） |
CMV IgM | 陰性 | C500 | 3529（陰性） | 3768（陰性） | 5782（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C228 | 5430（陰性） | 6048（陰性） | 2634（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C86 | 1945（陰性） | 2044（陰性） | 6851（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C471 | 2356（陰性） | 3086（陰性） | 3654（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C60 | 4879（陰性） | 5047（陰性） | 4810（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C348 | 2561（陰性） | 2758（陰性） | 5730（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C502 | 5873（陰性） | 6048（陰性） | 6820（陰性） |
CMV IgM | 陰性 | C377 | 5126（陰性） | 4985（陰性） | 7873（陰性） |
CMV IgM | 陽性 | CP1 | 175642（陽性） | 172484（陽性） | 145637（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP2 | 43215（陽性） | 149387（陽性） | 26548（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP3 | 57863（陽性） | 68240（陽性） | 65487（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP4 | 234561（陽性） | 234578（陽性） | 235611（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP5 | 108431（陽性） | 118524（陽性） | 102453（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP6 | 894321（陽性） | 824554（陽性） | 785421（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP7 | 345210（陽性） | 304117（陽性） | 301245（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP8 | 86510（陽性） | 86584（陽性） | 98703（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP9 | 76431（陽性） | 74438（陽性） | 103241（陽性） |
CMV IgM | 陽性 | CP10 | 421302（陽性） | 440378（陽性） | 486310（陽性） |
測試項目 | 樣品陰性/陽性 | 血清樣品編號 | 實施例2的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 實施例3的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 對比例2的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 |
|---|---|---|---|---|---|
TOXO IgG | 陰性 | C336 | 5412（陰性） | 6685（陰性） | 1251097（陽性） |
TOXO IgG | 陰性 | C348 | 5687（陰性） | 5487（陰性） | 6583（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C389 | 3654（陰性） | 1568（陰性） | 897621（陽性） |
TOXO IgG | 陰性 | C323 | 4628（陰性） | 5724（陰性） | 4598（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C369 | 5132（陰性） | 5252（陰性） | 168439（陽性） |
TOXO IgG | 陰性 | C350 | 2356（陰性） | 4435（陰性） | 19874（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C377 | 3541（陰性） | 2015（陰性） | 284710（陽性） |
TOXO IgG | 陰性 | C86 | 6874（陰性） | 7593（陰性） | 8910（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C60 | 3559（陰性） | 3554（陰性） | 5431（陰性） |
TOXO IgG | 陰性 | C102 | 6215（陰性） | 6861（陰性） | 7357（陰性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP1 | 275610（陽性） | 245810（陽性） | 259841（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP2 | 176354（陽性） | 203357（陽性） | 201684（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP3 | 96854（陽性） | 95794（陽性） | 102543（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP4 | 385672（陽性） | 307972（陽性） | 475689（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP5 | 46983（陽性） | 52988（陽性） | 49612（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP6 | 156432（陽性） | 142583（陽性） | 184256（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP7 | 179531（陽性） | 205953（陽性） | 135682（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP8 | 354613（陽性） | 330610（陽性） | 354621（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP9 | 254983（陽性） | 304988（陽性） | 201873（陽性） |
TOXO IgG | 陽性 | TP10 | 196543（陽性） | 195579（陽性） | 196826（陽性） |
測試項目 | 樣品陰性/陽性 | 血清樣品編號 | 實施例2的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 實施例3的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 對比例2的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 |
|---|---|---|---|---|---|
GAD65 | 陰性 | C336 | 5596（陰性） | 4586（陰性） | 516892（陽性） |
GAD65 | 陰性 | C348 | 3854（陰性） | 4573（陰性） | 4195（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C369 | 7261（陰性） | 6678（陰性） | 5792（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C323 | 4195（陰性） | 4458（陰性） | 7982（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C377 | 2943（陰性） | 3044（陰性） | 3018（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C321 | 6813（陰性） | 8427（陰性） | 5943（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C350 | 5192（陰性） | 6458（陰性） | 8019（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C60 | 5713（陰性） | 4397（陰性） | 3529（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C471 | 4952（陰性） | 5521（陰性） | 4695（陰性） |
GAD65 | 陰性 | C500 | 2946（陰性） | 3486（陰性） | 186452（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP1 | 50136（陽性） | 82754（陽性） | 49613（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP2 | 69842（陽性） | 75864（陽性） | 47621（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP3 | 163542（陽性） | 182475（陽性） | 98651（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP4 | 132549（陽性） | 124458（陽性） | 175626（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP5 | 50134（陽性） | 66457（陽性） | 56138（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP6 | 431562（陽性） | 337581（陽性） | 416235（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP7 | 150234（陽性） | 204574（陽性） | 153426（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP8 | 90125（陽性） | 100254（陽性） | 86423（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP9 | 176950（陽性） | 186990（陽性） | 214683（陽性） |
GAD65 | 陽性 | GP10 | 65432（陽性） | 66784（陽性） | 95634（陽性） |
由以上表5-7可見，包被該發明實施例2和3製備的磁性微球的TOXO抗原、GAD65抗原和CMV抗原分別與相應抗體陽性的樣本中的抗體產生良好的結合，而對於相應抗體陰性的樣本，則能檢測出完全陰性的信號。這表明了實施例2和3製備的磁性微球的表面活性基團與蛋白、即抗原連線能力極好，磁性微球表面的聚丙烯酸酯類聚合物完全不影響磁性微球表面的活性基團與蛋白的結合。
測試項目 | 血清樣品編號 | 實施例2的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 實施例3的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 | 對比例2的磁性微球的發光信號強度及陰性/陽性 |
|---|---|---|---|---|
TOXO IgG | C336 | 5613（陰性） | 6717（陰性） | 135649（陽性） |
TOXO IgG | C348 | 4201（陰性） | 4254（陰性） | 6739（陰性） |
TOXO IgG | C389 | 3265（陰性） | 3858（陰性） | 984352（陽性） |
TOXO IgG | C323 | 4952（陰性） | 5554（陰性） | 7762（陰性） |
TOXO IgG | C369 | 5169（陰性） | 4867（陰性） | 163852（陽性） |
TOXO IgG | C350 | 4821（陰性） | 2021（陰性） | 59613（陽性） |
TOXO IgG | C377 | 2956（陰性） | 3467（陰性） | 34162（陽性） |
TOXO IgG | C86 | 9543（陰性） | 10420（陰性） | 6591（陰性） |
TOXO IgG | C60 | 6830（陰性） | 7240（陰性） | 6135（陰性） |
TOXO IgG | C102 | 2465（陰性） | 1867（陰性） | 4261（陰性） |
GAD65 | C336 | 5913（陰性） | 6785（陰性） | 694351（陽性） |
GAD65 | C348 | 4256（陰性） | 4572（陰性） | 6521（陰性） |
GAD65 | C369 | 6289（陰性） | 4420（陰性） | 2564（陰性） |
GAD65 | C323 | 6205（陰性） | 5796（陰性） | 4694（陰性） |
GAD65 | C377 | 6031（陰性） | 6457（陰性） | 6191（陰性） |
GAD65 | C321 | 4316（陰性） | 4358（陰性） | 4603（陰性） |
GAD65 | C350 | 2546（陰性） | 2781（陰性） | 6405（陰性） |
GAD65 | C60 | 3194（陰性） | 3368（陰性） | 2019（陰性） |
GAD65 | C471 | 2468（陰性） | 2941（陰性） | 3461（陰性） |
GAD65 | C500 | 4619（陰性） | 5501（陰性） | 235874（陽性） |
CMV IgM | C336 | 3491（陰性） | 3934（陰性） | 191635（陽性） |
CMV IgM | C128 | 6159（陰性） | 6679（陰性） | 124671（陽性） |
CMV IgM | C500 | 3461（陰性） | 3587（陰性） | 3054（陰性） |
CMV IgM | C228 | 2016（陰性） | 2847（陰性） | 4916（陰性） |
CMV IgM | C86 | 3469（陰性） | 4013（陰性） | 2046（陰性） |
CMV IgM | C471 | 1954（陰性） | 2428（陰性） | 4671（陰性） |
CMV IgM | C60 | 5068（陰性） | 244618（陽性） | 2749（陰性） |
CMV IgM | C348 | 5319（陰性） | 5679（陰性） | 6942陰性） |
CMV IgM | C502 | 1605（陰性） | 1785（陰性） | 3491（陰性） |
CMV IgM | C377 | 3259（陰性） | 4840（陰性） | 5192（陰性） |
由表8可見，該發明實施例2和3製備的磁性微球與樣本中的抗體的非特異性吸附性能明顯低於對比例2中未採用該發明所製備的乳化液修飾的磁性微球基體與樣本中的抗體的非特異性吸附性能，而且，對於有些特殊的樣本，對比例2的測試結果更出現與臨床樣本不符合的虛高現象。以上實驗和數據表明了該發明實施例2和3的磁性微球具有減少或避免非特異性蛋白吸附的顯著效果。
實施例4
1）磁性微球基體的製備
按照中國專利公開CN102746529A中實施例1-6製備用於該實施例的磁性微球基體。
2）乳化液的製備
乳化液的組分及其質量百分比如下：甲基丙烯酸丁酯10%；1,6己二醇二甲基丙烯酸酯2%；過硫酸鉀1%；十二烷基硫酸鈉0.5%以及純化水86.5%。將上述各組分按比例混合，超聲處理，使其中固體組分全部溶解，然後在高剪下乳化機中乳化20分鐘。
3）分散體系製備
將步驟1）得到的磁性微球基體以50毫克/毫升的濃度分散於步驟2）所製備的乳化液中，並通過超聲處理，使磁性微球基體分散均勻，得到分散體系。
4）聚合反應和後處理
將步驟3）製備得到的分散體系在在75攝氏度下攪拌反應28小時，經磁鐵分離去上清液，固體用甲醇洗滌3次，水洗5次，得到磁性微球。
5）磁性微球表面活性基團連線性能的檢測
按照實施例1的步驟5）進行測試，不同之處在於，所使用的磁性微球替換為該實施例步驟4）製備得到的磁性微球。
從實驗結果數據（在此未列出）來看，該實施例製備得到的磁性微球的活性基團與抗原蛋白的結合能力與實施例1和2類似，包被該磁性微球的抗原與樣本中的抗體結合極好，而對陰性樣本展現出完全陰性的信號。
6）磁性微球非特異吸附檢測
按照重複實施例1的步驟6）進行測試，不同之處在於，所使用的磁性微球替換為該實施例步驟4）製備得到的磁性微球。
從實驗結果數據（在此未列出）來看，包被有抗原的該實施例製備的磁性微球在對樣本中的抗體進行吸附檢測時，與實施例1和2類似，非特異性吸附很少。
實施例5
1）磁性微球基體的製備
按照中國專利公開CN102746529A中實施例1-4製備用於該實施例的磁性微球基體。
2）乳化液的製備
乳化液的組分及其質量百分比如下：甲基丙烯酸乙酯10%；1,3丙二醇二甲基丙烯酸酯2%；過硫酸胺1%；正癸基硫酸鈉0.5%以及純化水86.5%。將上述各組分按比例混合，超聲處理，使其中固體組分全部溶解，然後在高壓勻質機中均質化20分鐘。
3）分散體系製備
將步驟1）得到的磁性微球基體以50毫克/毫升的濃度分散於步驟2）所製備的乳化液中，並通過超聲處理，使磁性微球基體分散均勻，得到分散體系。
4）聚合反應和後處理
將步驟3）製備得到的分散體系在在70攝氏度下攪拌反應24小時，經磁鐵分離去上清液，固體用甲醇洗滌3次，水洗5次，得到磁性微球。
5）磁性微球表面活性基團連線性能的檢測
按照實施例1的步驟5）進行測試，不同之處在於，所使用的磁性微球替換為該實施例步驟4）製備得到的磁性微球。
從實驗結果數據（在此未列出）來看，該實施例製備得到的磁性微球的活性基團與抗原蛋白的結合能力與實施例1和2類似，包被該磁性微球的抗原與樣本中的抗體結合極好，而對陰性樣本展現出完全陰性的信號。
6）磁性微球非特異吸附檢測
按照重複實施例1的步驟6）進行測試，不同之處在於，所使用的磁性微球替換為該實施例步驟4）製備得到的磁性微球。
從實驗結果數據（在此未列出）來看，包被有抗原的該實施例製備的磁性微球在對樣本中的抗體進行吸附檢測時，與實施例1和2類似，非特異性吸附很少。
實施例6
1）磁性微球基體的製備
按照中國專利公開CN102746529A中實施例1-4製備用於該實施例的磁性微球基體。
2）乳化液的製備
乳化液的組分及其質量百分比如下：甲基丙烯酸羥丙酯12%；1,3丙二醇二甲基丙烯酸酯2%；過硫酸鈉1%；十二烷基硫酸鈉0.5%以及純化水84.5%。將上述各組分按比例混合，超聲處理，使其中固體組分全部溶解，然後在高剪下乳化機中乳化20分鐘。
3）分散體系製備
將步驟1）得到的磁性微球基體以100毫克/毫升的濃度分散於步驟2）所製備的乳化液中，並通過超聲處理，使磁性微球基體分散均勻，得到分散體系。
4）聚合反應和後處理
將步驟3）製備得到的分散體系在在70攝氏度下攪拌反應20小時，經磁鐵分離去上清液，固體用乙醇洗滌3次，水洗5次，得到磁性微球。
5）磁性微球表面活性基團連線性能的檢測
按照實施例1的步驟5）進行測試，不同之處在於，所使用的磁性微球替換為該實施例步驟4）制各得到的磁性微球。
從實驗結果數據（在此未列出）來看，該實施例製備得到的磁性微球的活性基團與抗原蛋白的結合能力與實施例1和2類似，包被該磁性微球的抗原與樣本中的抗體結合極好，而對陰性樣本展現出完全陰性的信號。
6）磁性微球非特異吸附檢測
按照重複實施例1的步驟6）進行測試，不同之處在於，所使用的磁性微球替換為該實施例步驟4）製備得到的磁性微球。從實驗結果數據（在此未列出）來看，包被有抗原的該實施例製備的磁性微球在對樣本中的抗體進行吸附檢測時，與實施例1和2類似，非特異性吸附很少。
專利榮譽
2021年6月24日，《一種用於生物蛋白分離的磁性微球的製備方法及其套用》獲得第二十二屆中國專利優秀獎。
