《一種微生物轉化法製備膽固醇的方法》是河南利偉生物藥業股份有限公司於2012年5月24日申請的專利，該專利公布號為CN102676626A，公布日為2012年9月19日，發明人是馬志軍、薛家祿。
一種微生物轉化法製備膽固醇的方法完全通過微生物轉化，以羊毛脂為原料生產膽固醇，步驟包括1）將原料粉碎，加入碳源和氮源，製備種子培養基和發酵培養基；2）篩選菌種；3）接入菌種，攪拌發酵；4）分離提純結晶；上述方法製備膽固醇，具有條件溫和、反應專一、污染小等特點。通過該方法製得的膽固醇的純度較高，且收率大，符合環保理念。
2018年8月，《一種微生物轉化法製備膽固醇的方法》獲得第一屆河南省專利獎三等獎。
基本介紹
- 中文名：一種微生物轉化法製備膽固醇的方法
- 公布號：CN102676626A
- 公布日：2012年9月19日
- 申請號：2012101630470
- 申請日：2012年5月24日
- 申請人：河南利偉生物藥業股份有限公司
- 地址：河南省焦作市溫縣產業聚集區鑫源路中段
- 發明人：馬志軍、薛家祿
- 分類號：C12P33/00(2006.01)I、C12P33/00
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
羊毛脂是由羊皮脂腺分泌且粘附於羊毛毛被中的酯類物質的多組份混合物，主要是由脂肪酸與大致等量的脂肪醇、固醇、三甲基甾醇等所形成的酯。羊毛脂中約含有10％左右的膽固醇，膽固醇可作為一種具有生物活性的多功能化妝品助劑，美國CTFA（化妝品香料香精協會）化妝品原料手冊已經將膽固醇列為可加入化妝品的天然活性物質，膽固醇也是合成維生素D3的主要原材料。中國有大量的羊毛脂資源，研究從中提取膽固醇的技術很有意義。
截至2012年9月，從羊毛脂中提取膽固醇的方法大致分為五類：色譜法、溴化法、分子蒸餾法、超臨界萃取法、溶劑選擇結晶法和配合法。這些方法均為化學法，用到了多種有機溶劑，且反應過程中易產生多種副產物，容易造成環境污染，若處理，則需消耗大量的人力物力，不符合生態環保的科學理念且增加了企業的生產成本。
發明內容
專利目的
針對2012年9月之前技術的不足，該發明提供了一種微生物轉化法製備膽固醇的方法，以生物方法製備有機物，純度較高，且科學環保。
技術方案
《一種微生物轉化法製備膽固醇的方法》其特徵是：該方法完全通過微生物轉化，以羊毛脂為原料生產膽固醇，步驟如下：
1）將原料粉碎，加入碳源和氮源，製備種子培養基和發酵培養基；
2）篩選菌種；
3）接入菌種，攪拌發酵；
4）分離提純結晶；
進一步，所製備的種子培養基為：馬鈴薯汁1000毫升，糖類20克，瓊脂20克，羊毛脂30克；
進一步，所製備的發酵培養基為：馬鈴薯汁1000毫升～2000毫升，糖類90克～200克，瓊脂60克～150克，羊毛脂80克～150克；
優選的，所製備的發酵培養基為：馬鈴薯汁1000毫升，麥芽糖90克，瓊脂60克，羊毛脂80克；
進一步，所述的菌種篩選方法為：
1）在洗羊毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產工廠分別採集土壤樣品；
2）取上述採集的土壤樣品1.0克，置消毒試管中，加入無菌水10毫升後以渦旋振盪器振盪搖勻，靜置後取上層清液，滴於種子培養基上，以玻璃棒塗勻，置於27℃恆溫培養箱中培養2-5天，待平板上長出菌落後，挑出單菌落於種子培養基上，根據形態特徵判斷純的菌株，編號保存；
3）將分離得到的幾十個菌株分別接種在種子培養基中，待長出單菌落後，取菌落下面的培養基1.0克放置於試管中，加三氯甲烷10毫升並震盪，使培養基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10毫升；觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則此菌株具備轉化能力；若不顯血紅色，則不具備轉化能力；
4）將篩選獲得的菌株在種子培養基上培養，菌落質地緻密、表面呈較緊密的絨狀或堅實、乾燥、多皺，可初步猜測菌株為放線菌。
接著挑取細菌製作玻片，在顯微鏡下，細菌呈分枝絲狀，進一步確定菌株為放線菌。
進一步，將篩選獲得的放線菌置於發酵培養基中，進行發酵培養，取菌落下的培養基於具塞試管中，加入50%～100%的乙醇，充分震盪，然後加入乙醚，搖動，再加入石油醚，充分震盪後靜置使液層分離，取上層有機相用氮氣吹乾，並以50%～100%乙醇溶解反覆結晶；
進一步，發酵過程條件為：pH為6.0-8.5，溫度20-50℃，發酵時間70—160小時；
優選的，發酵過程條件為：pH為7.6，溫度30℃，發酵時間110小時。
改善效果
《一種微生物轉化法製備膽固醇的方法》的有益效果是：微生物轉化法是利用微生物的酶系進行催化的化學反應，具有條件溫和、反應專一、污染小等特點。更重要的是適當的微生物和合理的工藝開發研究，可以使原料直接發酵，得到較高收率的目標產物的同時起到了環保的作用。通過該方法製得的膽固醇的純度較高，且收率大，符合環保理念。
權利要求
1.《一種微生物轉化法製備膽固醇的方法》其特徵是：該方法完全通過微生物轉化，以羊毛脂為原料生產膽固醇，步驟如下：
1）將原料粉碎，加入碳源和氮源，製備種子培養基和發酵培養基；
2）篩選菌種；
3）接入菌種，攪拌發酵；
4）分離提純結晶。
2.根據權利要求1所述的微生物轉化法製備膽固醇的方法，其特徵是：所製備的種子培養基為：馬鈴薯汁1000毫升，糖類20克，瓊脂20克，羊毛脂30克。
3.根據權利要求1所述的微生物轉化法製備膽固醇的方法，其特徵是：所製備的發酵培養基為：馬鈴薯汁1000毫升～2000毫升，糖類90克～200克，瓊脂60克～150克，羊毛脂80克～150克。
4.根據權利要求1或3所述的微生物轉化法製備膽固醇的方法，其特徵是：所製備的發酵培養基為：馬鈴薯汁1000毫升，麥芽糖90克，瓊脂60克，羊毛脂80克。
5.根據權利要求1所述的微生物轉化法製備膽固醇的方法，其特徵是：所述的菌種篩選方法為：
1）在洗羊毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產工廠分別採集土壤樣品；
2）取上述採集的土壤樣品1.0克，置消毒試管中，加入無菌水10毫升後以渦旋振盪器振盪搖勻，靜置後取上層清液，滴於種子培養基上，以玻璃棒塗勻，置於27℃恆溫培養箱中培養2-5天，待平板上長出菌落後，挑出單菌落於新的種子培養基上，根據形態特徵判斷純的菌株，編號保存；
3）將分離得到的幾十個菌株分別接種在種子培養基中，待長出單菌落後，取菌落下面的培養基1.0克放置於試管中，加三氯甲烷10毫升並震盪，使培養基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10毫升；觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則此菌株具備轉化能力；若不顯血紅色，則不具備轉化能力；
4）將篩選獲得的菌株在種子培養基上培養，菌落質地緻密、表面呈較緊密的絨狀或堅實、乾燥、多皺，可初步猜測菌株為放線菌；
進一步挑取細菌製作玻片，在顯微鏡下觀察，細菌呈分枝絲狀，可進一步確定菌株為放線菌。
6.根據權利要求1所述的微生物轉化法製備膽固醇的方法，其特徵是：將篩選獲得的放線菌置於發酵培養基中，進行發酵培養，取菌落下的培養基於具塞試管中，加入50%～100%的乙醇，充分震盪，然後加入乙醚，搖動，再加入石油醚，充分震盪後靜置使液層分離，取上層有機相用氮氣吹乾，並以50%～100%乙醇溶解反覆結晶。
7.根據權利要求1或6所述的微生物轉化法製備膽固醇的方法，其特徵是：發酵過程條件為：pH為6.0-8.5，溫度20-50℃，發酵時間70—160小時。
8.根據權利要求1或6或7所述的微生物轉化法製備膽固醇的方法，其特徵是：發酵過程條件為：pH為7.6，溫度30℃，發酵時間110小時。
實施方式
- 實施例1
《一種微生物轉化法製備膽固醇的方法》通過微生物轉化，以羊毛脂為原料生產膽固醇，步驟如下：
土壤採集：在洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產工廠分別採集土壤樣品。
種子培養基：馬鈴薯汁1000毫升，糖類20克，瓊脂20克，羊毛脂30克。
發酵培養基：馬鈴薯汁1000毫升，麥芽糖90克，瓊脂60克，羊毛脂80克。
篩選菌種：取上述採集的土壤樣品1.0克，置消毒過的試管中，加入無菌水10毫升後以渦旋振盪器振盪搖勻，靜置後取上層清液，滴於平板培養基上，以玻璃棒塗勻，置於27℃恆溫培養箱中培養2-5天，待平板上長出菌落後，挑出單菌落於分離培養基上，根據形態特徵判斷純的菌株，編號保存。
將分離得到的幾十個菌株分別接種在培養基中，待長出單菌落後，取菌落下面的培養基1.0克放置於試管中，加三氯甲烷10毫升並震盪，使培養基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10毫升。觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則推測此菌株具備轉化能力；若不顯血紅色，則不具備轉化能力。
將篩選獲得的菌株在種子培養基上培養，菌落質地緻密、表面呈較緊密的絨狀或堅實、乾燥、多皺，初步猜測菌株為放線菌。
接著挑取細菌製作玻片，在顯微鏡下，細菌呈分枝絲狀，可進一步確定菌株為放線菌。
接入菌種，發酵培養：將篩選獲得的放線菌置於發酵培養基中，進行半固體培養基發酵培養，發酵過程條件為：pH為7.6，溫度30℃，發酵時間110小時。
分離提純結晶：然後取菌落下的培養基於具塞試管中，加入95%的乙醇，充分震盪，然後加入乙醚，搖動，再加入石油醚，充分震盪後靜置使液層分離，取上層有機相用氮氣吹乾，並以95%乙醇溶解反覆結晶。
- 實施例2
一種微生物轉化法製備膽固醇的方法，該方法完全通過微生物轉化，以羊毛脂為原料生產膽固醇，步驟如下：
土壤採集：在洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產工廠分別採集土壤樣品。
種子培養基：馬鈴薯汁1000毫升，糖類20克，瓊脂20克，羊毛脂30克。
發酵培養基：馬鈴薯汁1000毫升，葡萄糖90克，瓊脂60克，羊毛脂80克；
篩選菌種：取上述採集的土壤樣品1.0克，置消毒過的試管中，加入無菌水10毫升後以渦旋振盪器振盪搖勻，靜置後取上層清液，滴於平板培養基上，以玻璃棒塗勻，置於27℃恆溫培養箱中培養2-5天，待平板上長出菌落後，挑出單菌落於種子培養基上，根據形態特徵判斷純的菌株，編號保存。
將分離得到的幾十個菌株分別接種在種子培養基中，待長出單菌落後，取菌落下面的培養基1.0克放置於試管中，加三氯甲烷10毫升並震盪，使培養基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10毫升。觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則推測此菌株具備轉化能力;若不顯血紅色，則不具備轉化能力。
將篩選獲得的菌株在種子培養基上培養，菌落質地緻密、表面呈較緊密的絨狀或堅實、乾燥、多皺，初步猜測菌株為放線菌。
接著挑取細菌製作玻片，在顯微鏡下，細菌呈分枝絲狀，可進一步確定菌株為放線菌。
接入菌種，發酵培養：將篩選獲得的放線菌置於發酵培養基中，進行發酵培養，發酵過程條件為：pH為6.0，溫度20℃，發酵時間70小時。
分離提純結晶：然後取菌落下的培養基於具塞試管中，加入50%的乙醇，充分震盪，然後加入乙醚，搖動，再加入石油醚，充分震盪後靜置使液層分離，取上層有機相用氮氣吹乾，並以50%乙醇溶解反覆結晶；
- 實施例3
一種微生物轉化法製備膽固醇的方法，該方法完全通過微生物轉化，以羊毛脂為原料生產膽固醇，步驟如下：
土壤採集：在洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產工廠分別採集土壤樣品。
種子培養基：馬鈴薯汁1000毫升，糖類20克，瓊脂20克，羊毛脂30克。
發酵培養基：馬鈴薯汁1000毫升，蔗糖90克，瓊脂60克，羊毛脂80克。
篩選菌種：取上述採集的土壤樣品1.0克，置消毒過的試管中，加入無菌水10毫升後以渦旋振盪器振盪搖勻，靜置後取上層清液，滴於平板培養基上，以玻璃棒塗勻，置於27℃恆溫培養箱中培養2-5天，待平板上長出菌落後，挑出單菌落於分離培養基上，根據形態特徵判斷純的菌株，編號保存。
將分離得到的幾十個菌株分別接種在種子培養基中，待長出單菌落後，取菌落下面的培養基1.0克放置於試管中，加三氯甲烷10毫升並震盪，使培養基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10毫升。觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則推測此菌株具備轉化能力；若不顯血紅色，則不具備轉化能力。
將篩選獲得的菌株在種子培養基上培養，菌落質地緻密、表面呈較緊密的絨狀或堅實、乾燥、多皺，初步猜測菌株為放線菌。
接著挑取細菌製作玻片，在顯微鏡下，細菌呈分枝絲狀，可進一步確定菌株為放線菌。
接入菌種，發酵培養：將篩選獲得的放線菌置於發酵培養基中，進行發酵培養，發酵過程條件為：pH為8.5，溫度50℃，發酵時間160小時；
分離提純結晶：然後取菌落下的培養基於具塞試管中，加入95%的乙醇，充分震盪，然後加入乙醚，搖動，再加入石油醚，充分震盪後靜置使液層分離，取上層有機相用氮氣吹乾，並以95%乙醇溶解反覆結晶；
- 實施例4
一種微生物轉化法製備膽固醇的方法，該方法完全通過微生物轉化，以羊毛脂為原料生產膽固醇，步驟如下：
土壤採集：在洗毛廢棄物傾倒處和膽固醇生產工廠分別採集土壤樣品。
種子培養基：馬鈴薯汁1000毫升，糖類20克，瓊脂20克，羊毛脂30克。
發酵培養基：馬鈴薯汁1000毫升，麥芽糖90克，瓊脂60克，羊毛脂80克。
篩選菌種：取上述採集的土壤樣品1.0克，置消毒過的試管中，加入無菌水10毫升後以渦旋振盪器振盪搖勻，靜置後取上層清液，滴於平板培養基上，以玻璃棒塗勻，置於27℃恆溫培養箱中培養2-5天，待平板上長出菌落後，挑出單菌落於種子培養基上，根據形態特徵判斷純的菌株，編號保存。
將分離得到的幾十個菌株分別接種在種子培養基中，待長出單菌落後，取菌落下面的培養基1.0克放置於試管中，加三氯甲烷10毫升並震盪，使培養基中可能存在的膽固醇充分溶解，再加入硫酸10毫升。觀察，若三氯甲烷層顯血紅色，則推測此菌株具備轉化能力；若不顯血紅色，則不具備轉化能力。
將篩選獲得的菌株在種子培養基上培養，菌落質地緻密、表面呈較緊密的絨狀或堅實、乾燥、多皺，初步猜測菌株為放線菌。
接著挑取細菌製作玻片，在顯微鏡下，細菌呈分枝絲狀，可進一步確定菌株為放線菌。
接入菌種，發酵培養：將篩選獲得的放線菌置於發酵培養基中，進行發酵培養，發酵過程條件為：pH為7.0，溫度35℃，發酵時間120小時；
分離提純結晶：然後取菌落下的培養基於具塞試管中，加入75%的乙醇，充分震盪，然後加入乙醚，搖動，再加入石油醚，充分震盪後靜置使液層分離，取上層有機相用氮氣吹乾，並以75%乙醇溶解反覆結晶。
榮譽表彰
2018年8月，《一種微生物轉化法製備膽固醇的方法》獲得第一屆河南省專利獎三等獎。
