《生產普伐他汀鈉的微生物和方法》是上海天偉生物製藥有限公司於2003年7月9日申請的發明專利，該專利申請號為03141475，公布號為CN1566328A，專利公布日為2005年1月19日，發明人是梅民權、季曉銘、高霄梁、鄭扶桑、陳懿。
該發明提供了一種新的生產普伐他汀鈉的微生物及使用該微生物生產普伐他汀鈉的方法。該發明的粉白小多孢菌（Micropolysporaroseoalba）CGMCC0624對美伐他汀鈉的耐受性強，對美伐他汀鈉的轉化速度快，從而高效、低成本地生產普伐他汀鈉。
2010年11月15日，《生產普伐他汀鈉的微生物和方法》獲得第十二屆中國專利獎優秀獎。
（概述圖為《生產普伐他汀鈉的微生物和方法》的摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：生產普伐他汀鈉的微生物和方法
- 公布號：CN1566328A
- 公布日：2005年1月19日
- 申請號：03141475
- 申請日：2003年7月9日
- 申請人：上海天偉生物製藥有限公司
- 地址：上海市田林路300號田林大樓21號6樓
- 發明人：梅民權、季曉銘、高霄梁、鄭扶桑、陳懿
- 代理機構：上海專利商標事務所
- 代理人：徐迅
- Int.Cl.：C12N1/20
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,操作內容,實施案例,菌株保藏,榮譽表彰,
專利背景
心血管疾病己是人類死的主要原因，其發病率與死亡率都高居所有疾病之首。醫學研究證實心血管疾病的主要病理基礎為動脈粥樣硬化，高血脂症是導致動脈粥樣硬化的首要因素。因此降脂藥在減少心血管疾病發病率方面的重要性己引起人們的關注，各國竟相研究開發降血脂藥物。
在眾多降血脂藥物中，二十世紀八十年代初發展起來的一類化合物，它們是羥甲基戊二醯輔酶A還原酶抑制劑（HMG-CoAreductaseinhibitor），由於它們降低膽固醇的高效性，抑制膽固醇合成的高度選擇性以及低毒性，正成為心血管藥物研究中最活躍，發展最迅速的領域。
這類藥物又被稱為他汀類藥物，包括洛伐他汀（lovastatin），辛伐他汀（simvastatin），普伐他汀（pravastatin），氟伐他汀（fluvastatin），西立伐他汀（cerivastatin），阿伐他汀（atorvastatin）等。
和同類藥物相比，普伐他汀具有獨特的組織選擇性，它選擇性抑制肝臟及小腸內的膽固醇合成，但僅微弱抑制其它器官中的膽固醇合成，此外它還具有低毒性的優點。
普伐他汀鈉（PravastatinSodi微米，式I）生產是通過微生物對其前體藥物美伐他汀（Mevastatin，式IIa）或美伐他汀的鹽（Mevastatinsalt，式IIb）羥基化而得到。
其中美伐他汀（IIa）的水溶性差，因此通常通過加入鹼而將式IIa轉變為美伐他汀的鹽（式IIb，式中R＝鹼金屬（如Na、K）、鹼土金屬、和NH4）。
生產美伐他汀鈉的生物轉化可以多種微生物進行，主要為以下幾類：黴菌的多個屬（Mortierella，WO00/46175），諾卡氏菌（Norcardia，US5830695），馬杜拉放線菌（Actinomadura，WO96/40863），鏈黴菌（StreptomycesCarbopilusEP215665，StreptomycesexfoliatusWO98/45410），小單孢菌（Micromonospora）。
但上述各菌種在生產過程中都有一個缺點：由於普伐他汀的前體美伐他汀對於微生物具有較強的毒性，尤其是黴菌，因而在工業化生產過程中美伐他汀僅能維持在較低的濃度，且轉化速度也較慢，這大大提高了普伐他汀微生物轉化的生產成本。
因此，大規模工業化生產迫切需求開發高效率生產普伐他汀鈉的微生物和相應的生產工藝。
發明內容
技術方案
在該發明的第一方面，提供了一種粉白小多孢菌（Micropolysporaroseoalba），其保藏號是CGMCC0624。
在該發明的第二方面，提供了該發明上述粉白小多孢菌的用途，它被用於生產普伐他汀鈉。
在該發明的第三方面，提供了一種生產普伐他汀或其鹽的方法，包括以下步驟：
（a）在28-35℃，pH6.8-7.5條件下，培養保藏號CGMCC0624的粉白小多孢菌（Micropolysporaroseoalba）；
（b）加入美伐他汀或其鹽，維持美伐他汀濃度在0.005-0.5wt％，持續2-6天；
（c）停止加入美伐他汀或其鹽；
（d）分離出普伐他汀或其鹽。
在另一優選例中，步驟（b）中維持美伐他汀或其鹽濃度在0.01-0.05wt％。
在另一優選例中，步驟（b）的持續時間為3-5天。
在另一優選例中，步驟（d）是當美伐他汀或其鹽的濃度低於1毫克/升後，才開 始分離普伐他汀鈉。
在另一優選例中，步驟（b）和（c）中美伐他汀是美伐他汀鈉。
在另一優選例中，步驟（d）中分離出的普伐他汀鹽是普伐他汀鈉。
改善效果
《生產普伐他汀鈉的微生物和方法》的主要優點在於：該發明菌株對美伐他汀鈉的耐受性強，生產過程中美伐他汀鈉可維持在較高濃度。對美伐他汀鈉的轉化速度快，導致生產成本大幅下降。
附圖說明
圖1顯示了用《生產普伐他汀鈉的微生物和方法》微生物製備的普伐他汀鈉的H核磁共振波譜。
圖1
權利要求
1.一種粉白小多孢菌（Micropolysporaroseoalba），其特徵在於，其保藏號是CGMCC0624。
2.如權利要求1所述的粉白小多孢菌的用途，其特徵在於，用於生產普伐他汀鈉。
3.一種生產普伐他汀或其鹽的方法，其特徵在於，包括以下步驟：
（a）在28-35℃，pH6.8-7.5條件下，培養保藏號CGMCC0624的粉白小多孢菌（Micropolysporaroseoalba）；
（b）加入美伐他汀或其鹽，維持美伐他汀濃度在0.005-0.5wt％，持續2-6天；
（c）停止加入美伐他汀或其鹽；
（d）分離出普伐他汀或其鹽。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟（b）中維持美伐他汀或其鹽濃度在0.01-0.05wt％。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟（b）的持續時間為3-5天。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟（d）是當美伐他汀或其鹽的濃度低於1毫克/升後，才開始分離普伐他汀鈉。
7.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟（b）和（c）中美伐他汀或其鹽是美伐他汀鈉。
8.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟（d）中分離出的普伐他汀鹽是普伐他汀鈉。
實施方式
操作內容
《生產普伐他汀鈉的微生物和方法》的粉白小多孢菌TW-9918已於2001年8月29日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（中國，北京），編號為CGMCC0624。
該發明的生產方法，除了生產菌和發酵條件不同之外，其他條件與2003年7月之前技術中生產普伐他汀鈉的方法基本相同，例如普伐他汀鈉的分離和純化工藝。
該發明菌株的發酵條件與一般的小多孢菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培養基中，在pH6.8-7.5（較佳地pH7.0-7.2）和25-38℃（較佳地28-35℃）上發酵。
一些優選的培養基如下：
斜面培養基採用酵母麥芽瓊脂（ISP2），其組成為：麥芽抽提物1.0％，酵母抽提物0.4％，葡萄糖0.4％，瓊脂2.0％，pH7.0-7.2。
種子培養基組成為：葡萄糖0.2-5.0％，酵母抽提物0.05-0.5％，蛋白腖0.1-2.0％，磷酸氫二鉀0.02-0.1％，pH7.0-7.2。
發酵用培養基組成為：葡萄糖1.0-5.0％，酵母抽提物0.1-1.0％，蛋白腖0.5-2.0％，K2HPO40.01-0.5％，MgSO4·7H2O0.01-0.05％，pH7.0-7.2。
一種優選的用TW-9918菌株轉化美伐他汀為普伐他汀的生產過程如下：
TW-9918於28℃在斜面上培養7-10天后即成熟。取成熟斜面上的菌絲接入種子培養基，然後於28℃在搖床上以轉速210轉/分鐘培養2-3天。
發酵培養基接入5-15％種子培養液，然後置於搖床或在發酵罐內培養，培養溫度為28-35℃。菌體生長12-24小時後，每天補入0.2-2.0％的葡萄糖，並同時補入美伐他汀使培養液中美伐他汀濃度維持在0.005-0.5wt％（較佳地0.01-0.05％）。轉化培養一般進行2-6天（較佳地3-5天）後即停止補加美伐他汀，待培養液中美伐他汀濃度低於1毫克/升即終止。
發酵液通過離心去除菌體，上清液由疏水樹脂吸附，以水洗滌樹脂，普伐他汀鈉以乙醇/水混合溶液或丙酮/水混合溶液洗脫，收集普伐他汀部分，濃縮。濃縮液經乙酸乙酯萃取，乙醇/乙酸乙酯結晶得普伐他汀鈉純品。
實施案例
- 實施例1
普伐他汀鈉生產菌株的獲得和鑑定
1.微生物的分離篩選
從中國各地採集得到的土壤樣本以10-2-10-6稀釋然後鋪於平板上，平板於28℃恆溫培養7-10天。共約1,500個菌株被分離出來用於搖瓶篩選。其中有3株菌株具有美伐他汀轉化能力，其中一株從中國寧波土壤分離所得的TW-9918顯示出對美伐他汀的高耐受性，並能高效轉化為普伐他汀。
2.微生物的鑑定
形態特徵：
TW-9918在桑塔斯瓊脂和葡萄糖天冬醯胺瓊脂上生長5-10天后，氣生菌絲上形成3-12個孢子的短鏈，孢子絲直絲；基內菌絲有橫隔，斷裂，並產生少量短孢子鏈。孢子橢圓形，0.85×1.5微米，表面光滑。
培養特徵：
TW-9918在七種培養基上28℃生長7-15天的特徵如下：
培養基 | 氣生菌絲 | 基內菌絲 | 可溶性色素 |
|---|---|---|---|
酵母麥芽瓊脂（ISP2） | 粉灰色 | 淺黃色 | 無 |
桑塔斯瓊脂 | 粉灰白 | 淺黃色 | 無 |
葡萄糖天門冬素瓊脂 | 粉白 | 淺黃色 | 無 |
蔗糖硝酸鹽 | 淺肉色 | 砂石黃 | 無 |
營養瓊脂 | 粉灰紅 | 污黃色 | 無 |
燕麥粉瓊脂（ISP3） | 荷花白色 | 暗黃色 | 無 |
土豆汁瓊脂 | 灰白 | 淺褐色 | 無 |
化學分類
細胞壁組分分析：
菌株TW-9918的細胞壁中含有mdso-DAP（二氨基庚二酸，Diaminopimelicacid），甘氨酸（細胞壁IV型）。
全細胞糖型分析：
菌株TW-9918水解液中含有半乳糖和阿拉伯糖（糖型A）。
枝菌酸分析：
菌株TW-9918不含枝菌酸。
實驗項目 | 結果 | 實驗項目 | 結果 |
|---|---|---|---|
D-葡萄糖 | + | 明膠液化 | - |
L-阿拉伯糖 | + | 牛奶凝固 | - |
D-木糖 | + | 牛奶腖化 | + |
D-果糖 | + | 澱粉水解 | - |
蔗糖 | + | 硝酸鹽還原 | + |
L-鼠李糖 | + | 硫化氫產生 | - |
D-甘露糖 | - | 酪氨酸酶 | - |
棉籽糖 | + | / | |
L-肌醇 | + | ||
菌種鑑定結果：
根據形態特徵與細胞壁化學組分定屬的原則，TW-9918基絲有橫隔、斷裂；氣生菌絲和基內菌絲都有短的孢子鏈；細胞壁為IV型，糖型為A，無枝菌酸，屬於小多孢菌屬（Micropolyspora）。又根據培養特徵和生理生化特徵定種的原則，菌株TW-9918氣生菌絲灰白、粉白；基內菌絲淺黃色調，無可溶性色素；結合生理生化特徵，菌株TW-9918與粉白小多孢菌相似，故劃歸為粉白小多孢菌（Micropolysporaroseoalba）。
- 實施例2
在該實施例中，用TW-9918生產普伐他汀鈉。
在一個250毫升搖瓶中加入50毫升種子液。種子液的配方組成如下：葡萄糖2.0％，酵母抽提物1.0％，蛋白腖1.0％，pH7.2。種子液在121℃滅菌20分鐘，冷卻後接入TW-9918菌種，在搖床上28℃培養2天，搖床轉速210轉/分鐘。
2天后分別取10毫升種子培養液接入含有100毫升發酵培養基的2個500毫升搖瓶中，於搖床上30℃培養，搖床轉速290轉/分鐘。發酵培養基組成為：葡萄糖2.0％，酵母抽提物0.5％，蛋白腖2.0％，K2HPO40.05％，MgSO4·7H2O0.05％，pH7.2，121℃滅菌20分鐘。培養24小時後開始補糖，葡萄糖每天加量為2.0％。溶液中的美伐他汀含量用HPLC檢測，通過補加美伐他汀鈉鹽水溶液使其濃度維持在0.01％-0.05％。4天后培養結束，共加入美伐他汀0.6g（3g/L）。
發酵終止後培養液離心去除菌體，上清液約為180毫升，以100毫升HP-20樹脂吸附，吸附完後，以500毫升蒸餾水洗滌，然後以50％丙酮洗脫，收集含普伐他汀鈉部分，濃縮；濃縮液經脫色，乙酸乙酯萃取，乙醇/乙酸乙酯結晶製得普伐他汀鈉純品0.2g。
- 實施例3
在該實施例中用TW-9918在5L全自動發酵罐生產普伐他汀鈉。
在一個5L全自動發酵罐中共裝有3.5升發酵培養基，於121℃滅菌20分鐘，冷卻後接入300毫升種子液，種子液培養方法同實施例2。發酵培養基的配方為：葡萄糖2.0％，酵母抽提物1.0％，蛋白腖2.0％，K2HPO40.1％，MgSO4·7H2O0.05％。
發酵在30℃進行，通氣量為3L/分鐘，攪拌轉速300-500rpm。當發酵進行到18小時開始連續補加美伐他汀鈉鹽水溶液及葡萄糖溶液，並維持美伐他汀濃度為0.03-0.05％，轉化持續到96小時結束，共加入美伐他汀20g（5.7g/L）。
轉化液按實施例2相同方法純化，精製後共得普伐他汀鈉7.6g。製得的普伐他汀鈉的H核磁共振波譜如圖1所示，與普伐他汀鈉標準品相同。
菌株保藏
該發明的粉白小多孢菌（Micropolysporaroseoalba）TW-9918已於2001年8月29日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（中國，北京），編號為CGMCC0624。
榮譽表彰
2010年11月15日，《生產普伐他汀鈉的微生物和方法》獲得第十二屆中國專利獎優秀獎。
