一種aFGF脂質體、製備方法及其套用

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》是廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心於2008年1月25日申請的專利，該專利的公布號為CN101491498，授權公布日為2009年7月29日，發明人是黃亞東、李校堃、項琪、蘇志堅、趙文、張卉。

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》涉及藥物製劑及化妝品領域，具體涉及一種aFGF脂質體、製備方法及其套用。該aFGF脂質體包括以下組分及含量(重量百分數)：aFGF 1.2％～3.5％，保護劑20％～25％，大豆磷脂4.5％～6.5％，膽固醇2.3％～3.3％。

2018年12月20日，《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》獲得第二十屆中國專利獎優秀獎。

基本介紹

• 中文名：一種aFGF脂質體、製備方法及其套用
• 公告號：CN101491498
• 授權日：2009年7月29日
• 申請號：2008100260022
• 申請日：2008年1月25日
• 申請人：廣州暨南大學醫藥生物技術研究開發中心
• 地址：廣東省廣州市中山大道105號37號4樓
• 發明人：黃亞東、李校堃、項琪、蘇志堅、趙文、張卉
• Int.Cl.：A61K9/127(2006.01)I; A61K9/10(2006.01)I; A61K47/24(2006.01)I; A61K38/18(2006.01)I等
• 類別：發明專利

專利背景

人酸性成纖維細胞生長因子（aFGF）是一類對來源於中胚層和神經外胚層的多種類型的細胞，具有廣泛的生物學活性，主要分布於腦、垂體、神經組織、視網膜、腎上腺、心臟和骨等器官或組織內，在其它組織中含量很少。FGF可促進血管生成、創傷癒合、骨骼修復、潰瘍癒合、眼晶狀體再生、神經組織修復、神經突起的生長以及胚胎的發育與分化。創傷癒合在臨床上經常遇到的難題是，燒傷等開放性創傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病或感染等原因常會造成創面癒合障礙。因此，如何縮短治療時間、提高癒合質量是目前臨床上待解決的課題。研究證實，aFGF和bFGF可促進各種組織損傷的修復，改善傷口的癒合。此外，與表皮生長因子（EGF）相比較，EGF可促進I型膠原的合成，導致瘢痕疙瘩形成；而FGF能通過對αI型前膠原基因表達的下行調節作用，抑制成纖維細胞的膠原合成，減少成纖維細胞的膠原蛋白的過量沉積，有助於防止瘢痕疙瘩的產生。因而套用aFGF和bFGF治療燒傷創面和慢性難愈性傷口（如：褥瘡、慢性感染的傷口，糖尿病、營養缺乏症、類固醇化病人的傷口，以及放射性傷口等），有著廣闊的前景，可提高這類病人的傷口癒合速度和質量，進而提高患者的生活質量

aFGF（酸性成纖維細胞生長因子）是一種多功能強力的細胞因子，對促進成纖維細胞的代謝和膠原蛋白的形成發揮著重要功能。臨床試驗證明：aFGF對皮膚光澤、滋潤、柔軟、減皺等綜合效果評價，其有效率達到93％，對祛粉刺、祛色斑、增白、改善皮膚彈性、損傷皮膚修復等綜合效果評價，有效率達到95％。如果體內或皮膚組織中細胞因子缺乏或者失去生理平衡，不但會促進和加快皮膚老化的過程，而且還會使正常皮膚組織出現一系列生理功能障礙，甚至誘導病理性皮膚問題的出現。正是由於aFGF的獨特生理作用和生物效應，使它成為最有潛力的新型產品，為美容業帶來了極其廣闊的美好前景。

但是，由於aFGF本身具有常溫穩定性差，易降解，易失活；生物利用度低、半衰期短、代謝迅速等缺點，在常規劑型套用中存在諸如穩定性差、給藥方式單一、用藥損傷大、生物利用度低等眾多缺點。截至2008年1月25日，市售的aFGF主要有凍乾製劑和液體製劑，尚未見其他劑型報導。脂質體做為多肽、蛋白類藥物的載體，具有眾多優點和用途，已被廣泛套用於製藥和化妝品中。中國以外許多知名企業紛紛以不同方式介入脂質體藥物的市場開發，並湧現了一批專門從事脂質體研究開發的公司如：INEX公司、Biomira公司等，它們均擁有自己的脂質體專利技術和產品。與此同時，各類脂質體新藥紛紛上市，並迅速擴大國際醫藥市場。近年來，伴隨生物技術的蓬勃發展，多肽、蛋白類藥物脂質體產品的開發也取得了巨大的進步，如BemaBiotech公司採用Virosome技術，在脂質體的磷脂雙分子層上嵌入病毒膜蛋白，製備脂質體疫苗。已經成功開發InflexalV流感疫苗和EpaxalA肝疫苗兩個產品。是奧地利的Polymun公司，以交叉流注射（cross-flowinjection）技術研究了可產業化的人Cu-Zn超氧化物歧化酶脂質體。在中國，多肽蛋白類藥物脂質體的開發也取得了可喜的成就，截至到2006年，中國已經先後批准口服尿激酶脂質體凍乾品、人降鈣素基因相關肽脂質體注射液、重組干擾素α2b脂質體乳膏和注射用尿激酶脂質體凍乾品等四個多肽、蛋白類藥物脂質體產品。

該專利將酸性成纖維細胞生長因子（aFGF）製備成脂質體，可作為原料，輔以其他的活性物質及輔料，製備成常用的藥劑形態發揮aFGF的藥效，或者與其他生物美容活性物質如透明質酸等一起，通過相應的製備工藝，製成水劑、霜劑、乳劑等護膚品，達到皮膚損傷的快速修復，皺紋的修復與祛皺，防曬、輻射檢驗後的護理，敏感性皮膚護理、各類疤痕的祛除修復等功效。

發明內容

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》的一個目的是利用脂質體對aFGF進行保護。脂質體包裹aFGF進入脂質囊泡後，可有效避免aFGF與外界環境（如酸鹼度等）的直接接觸失活。對aFGF起到較好的保護作用。

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》的另一個目的是利用脂質體的細胞親和性與生物相容性提高aFGF的利用率。脂質體囊泡具有類似生物膜脂質雙分子層結構，對正常細胞和組織無損害和抑制作用，並可長時間吸附於靶細胞周圍，使aFGF能向靶細胞透過，aFGF脂質體也能通過融合進入細胞內，經溶酶體消化釋放出aFGF，提高療效。[0008]《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》的另一個目的是利用脂質體緩慢釋藥的特性實現aFGF的長效作用。脂質體的脂質囊泡具有貯存藥物的作用，製成aFGF脂質體後給藥，藥物的釋放需要先透過磷脂膜因此釋放緩慢持久。[0009]《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》提供了一種aFGF脂質體，包含1.2％～3.5％重量的aFGF、4.5％～6.5％重量的磷脂、2.3～3.3％重量的膽固醇、和20～25％重量的保護劑。

在《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》中，所述的aFGF選自基因工程發酵純化提取的aFGF，其宿主菌選自大腸桿菌BL21（DE3）、BL21（DE3）rosatta、BL21（DE3）plyss，優選BL21（DE3）菌株。

按照《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》，所述的磷脂為天然大豆磷脂、氫化磷脂、合成磷脂雙肉豆蔻磷脂醯膽鹼（DMPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二肉豆蔻醯磷脂甘油（DMPG）、二棕櫚醯磷脂醯甘油（DPPG）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二硬脂酸磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二棕櫚醯磷脂酸（DPPA）和聚乙二醇2000-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（DSPE-PEG2000）等，優選氫化磷脂或DSPE-PEG2000。

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》的脂質體可以為混懸液的形式，進一步包含高分子材料如0.5％～3％的PVP作為助懸劑。其中所述的脂質體平均粒徑為100-300納米，優選200納米。

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》的脂質體可以為凍乾產品的形式，進一步包含甘露醇。

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》還提供了一種根據權利要求1所述的aFGF脂質體的製備方法，包含以下步驟：

（1）利用LB培養液發酵，菌體破碎液通過陽離子交換層析、肝素親和層析柱、HPLC進行分離，收集的aFGF蛋白；

（2）加入磷脂與膽固醇混勻後，加無水乙醇溶解得脂質溶液，蒸發，製成脂質薄膜；

（3）脂質薄膜水溶液水合，震盪，或將（2）中的脂質溶液直接與水溶液震盪混合，製成脂質分散水溶液；

（4）將脂質分散水溶液經超聲、乳化、過濾；

（5）調節脂質分散水溶液pH值至6.8，與aFGF及蛋白保護劑孵育，濾膜過濾，得aFGF脂質體溶液。

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》還涉及aFGF脂質體在製備用於治療急慢性創面修復，燒傷等開放性創傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病或感染等原因常會造成創面癒合藥物製劑中的套用。按照《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》，所述的藥物製劑優選為透皮藥物製劑。

《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》還涉及上述的aFGF脂質體在美容中的套用。

權利要求

1.一種aFGF脂質體，其用作透皮藥物製劑，包含1.2％～3.5％重量的aFGF、4.5％～6.5％重量的磷脂、2.3～3.3％重量的膽固醇、和20～25％重量的保護劑。

2.根據權利要求1所述的aFGF脂質體，其中所述的aFGF選自基因工程發酵純化提取的aFGF，其宿主菌選自大腸桿菌BL21（DE3）、BL21（DE3）rosetta和BL21（DE3）plyss。

3.根據權利要求1所述的aFGF脂質體，其中所述的磷脂選自天然大豆磷脂、氫化磷脂、合成磷脂雙肉豆蔻磷脂醯膽鹼（DMPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二肉豆蔻醯磷脂甘油（DMPG）、二棕櫚醯磷脂醯甘油（DPPG）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二硬脂酸磷脂醯乙醇胺（DSPE）、二棕櫚醯磷脂酸（DPPA）和聚乙二醇2000-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（DSPE-PEG2000）。

4.根據權利要求1所述的aFGF脂質體，其中所述的脂質體為混懸液的形式，進一步包含高分子材料作為助懸劑。

5.根據權利要求1所述的aFGF脂質體，其中所述的脂質體平均粒徑為100-300納米。

6.根據權利要求1所述的aFGF脂質體，其中所述的脂質體為凍乾產品的形式，進一步包含甘露醇。

7.一種根據權利要求1所述的aFGF脂質體的製備方法，包含以下步驟：

（1）利用LB培養液發酵，菌體破碎液通過陽離子交換層析、肝素親和層析柱、HPLC進行分離，收集aFGF蛋白；

（2）加入磷脂與膽固醇混勻後，加無水乙醇溶解得脂質溶液，蒸發，製成脂質薄膜；

（3）脂質薄膜水溶液水合，震盪，或將（2）中的脂質溶液直接與水溶液震盪混合，製成脂質分散水溶液；

（4）將脂質分散水溶液經超聲、乳化、過濾；

（5）調節脂質分散水溶液pH值至6.8，與aFGF及蛋白保護劑孵育，濾膜過濾，得aFGF脂質體溶液。

8.根據權利要求1所述的aFGF脂質體在製備用於急慢性創面修復，開放性創傷、潰瘍、褥瘡、糖尿病或感染原因造成的難愈性創面治療的透皮藥物製劑中的套用。

9.權利要求1所述的aFGF脂質體在美容中的套用。

實施方式

• 實例一、aFGF脂質體的製備（一）

稱取一定量的大豆卵磷脂和膽固醇，溶於無水乙醇中，於50℃恆溫水浴減壓旋轉蒸發，抽至無水乙醇揮盡，形成均勻薄膜，加入一定濃度的檸檬酸溶液適量，50℃恆溫水浴溫育2小時，間歇超聲分散，過0.22微米微孔濾膜整粒，適量aFGF原液與保護劑混合後加入，溶液調pH為6.8，37℃孵育20分鐘，即得。

• 實施例二、aFGF脂質體的製備（二）

將脂質體成膜劑（磷脂和膽固醇按照重量比4∶1）加入燒杯中，加入2-6倍量的氯仿溶解，將溶液加入茄形瓶中，在35-45℃水浴中加熱減壓旋轉乾燥，揮盡有機溶劑，加入含有aFGF、右旋糖苷和PEG4000的緩衝鹽溶液（pH6.8），4℃水化12小時，冰浴下間斷超聲10分鐘，0.22微米微孔濾膜超濾，分裝，加入甘露醇凍乾，即得。

• 實例三、aFGF脂質體的穩定性研究

分別將上述3批aFGF脂質體、aFGF水溶液於溫度40℃、相對濕度75％條件下密閉放置。於放置後0、1、2、3月。分別用ELISA法測定脂質體和水溶液中aFGF的含量，以0月時脂質體和水溶液中aFGF含量為100％，其它各時間藥物含量與之作比較，得出藥物含量隨時間變化百分率，結果表明，經溫度40℃、相對濕度75％條件下，放置3個月，aFGF在脂質體中藥物含量變化不大，而aFGF在水溶液中藥物含量降低，證實aFGF用脂質體包封后，能明顯提高藥物的穩定性。

實施例四：aFGF脂質體對糖尿病大鼠深二度燙傷創面癒合的作用實驗方法

1、實驗動物及分組

SPF級SD大鼠78隻，雌雄各半（廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格號：SCXK（粵）2003-0001粵監證字2006A014，八周齡，體重220-270g，所有動物隨機分成7組，每組12隻：aFGF脂質體（實施例1）高、中、低三個劑量組；空白脂質體組（空白基質組）；aFGF原液組（陽性對照組）；生理鹽水組（陰性對照組）；正常組。

大鼠於暨南大學動物飼養室適應性飼養一周，自由飲水、飲食。實驗前禁食12小時，自由飲水。

2、糖尿病大鼠燙傷模型的製備

大鼠予65mg/kg體重STZ（以無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉鎂液配成2％溶液，pH4.5），腹腔內一次注射誘導糖尿病，注射一周后尾靜脈採血，檢測隨機血糖水平和體重變化；若誘導劑注射前基礎血糖＜8.9摩爾/升，誘導後血糖水平＞11.2摩爾/升，大鼠體重明顯下降，隨機抽樣的胰腺組織學觀察證實胰島細胞被破壞即可視為糖尿病模型成功。誘導成功二月後，實驗大鼠經3％的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（劑量：1.5毫升/千克體重），用脫毛劑（8％Na₂S）大鼠背部淨毛，面積為6厘米×5厘米。用自製大鼠燙傷器（銅製，直徑1.8厘米圓形烙鐵）於100℃開水中煮沸10分鐘後迅速在距大鼠背中部脊柱兩側1.5厘米處，各燙一個圓形創面，每隻大鼠兩個創面，直徑1.8厘米，面積2.54平方厘米，燙傷時間30秒。損傷程度為深II度。

3、給藥

3.1給藥方法：①取配製好的高劑量組、中劑量組、低劑量組aFGF脂質體混懸液（120微克/毫升，25微克/毫升，5微克/毫升），aFGF原液（25微克/毫升）和空白脂質體混懸液100微升，用微量移液器均勻滴加於燙傷創面，塗抹均勻。模型組以生理鹽水代替藥物塗抹於創面。②上藥5分鐘後，創面用滅菌凡士林紗布包紮，各組燙傷後當天即開始給藥，以後隔天換藥一次，至第24天創面完全癒合。③各組動物分籠飼養，自由攝食，飲水。

4.藥效學評價方法

4.1創面觀察

4.1.1創面形態觀察

於燙傷後第3天、7天、14天、21天、24天肉眼觀察燙傷創面炎症狀況。

4.1.2創面癒合時間

從燙傷後即開始計時，記錄各組創面癒合時間。

4.1.2創面動態癒合率

於燙傷後第3天、7天、14天、21天、24天，採用透明膜描記稱量法，計算創面癒合百分率。

4.2組織病理形態學評價。

於燙傷後第7天、14天、21天處死動物，取燙傷創面全層皮膚及周圍1厘米2正常皮膚用10％甲醛固定，HE染色觀察組織病理變化。

5、統計學分析方法

採用SPSS13.0軟體對實驗數據進行統計學處理。結果以表示，兩因素析因設計資料

採用其方差分析進行統計分析，組間均數差異顯著性以q檢驗判別；成組設計資料採用t檢驗進行統計分析。P＜0.05為差異顯著；P＜0.01為差異非常顯著。

結果

1.創面觀察

1.1創面形態觀察

1.1.1創面癒合基本情況：大鼠經燙傷後日常活動及飲食未見異常。1d內可見燙傷部位形成水泡，創面整體發白，組織略有淤血，但燙傷面無明顯界限。第3天見燙傷面顏色加深，界限明顯，並逐漸形成深色硬痂。3～5天開始痂皮邊緣翹起、上翻。第7～9天開始有痂皮脫落。隨著治療的進行，燙傷面逐漸縮小至完全癒合，新生表皮組織逐漸形成。

1.2創面癒合時間

表4給出了不同試驗組創面癒合時間數據，試驗數據顯示：aFGF脂質體高、中劑量組、空白脂質體（基質）組和aFGF原液（陽性對照）組的創面癒合時間較陰性對照組有顯著提前（P＜0.01），創面癒合時間較陰性對照組分別提前4.2天、5.0天、3.3天和3.8天；aFGF脂質體低劑量組的創面癒合時間與陰性對照組比較有差別（P＜0.05）創面癒合時間較陰性對照組提前2.1天；aFGF脂質體高劑量組創面癒合時間與aFGF原液（陽性對照）組相近；aFGF脂質體中劑量組的創面癒合時間較空白脂質體（基質）組有明顯提前（P＜0.05）創面癒合時間較空白脂質體（基質）組提前1.7天。另外，aFGF脂質體中劑量組的創面癒合時間較高劑量組提前；顯示：aFGF中劑量給藥創面癒合有明顯提早。

與陰性對照比較：*P＜0.05**P＜0.01；與空白脂質體比較：+P＜0.05++P＜0.01

1.3創面動態癒合率

以燙傷後第3天時的創面面積為原始創面面積，計算其他各時相點的創面癒合百分率，實驗結果見表5-2。

與陰性對照比較：*P＜0.05**P＜0.01；與空白脂質體比較：+P＜0.05++P＜0.01

分析表5中數據可以看出：①燙傷後第7天組中，aFGF脂質體中劑量組的創面癒合率顯著性高於陰性對照組（P＜0.01）和空白脂質體（基質）組（P＜0.05）的創面癒合率；②燙傷後第14天時，aFGF脂質體中劑量組、aFGF脂質體高劑量組和aFGF原液（陽性對照）組的創面癒合率顯著性高於陰性對照組（P＜0.01）。aFGF脂質體中劑量組和aFGF脂質體高劑量組的創面癒合率顯著性高於空白脂質體（基質）組（P＜0.01）；③燙傷後第21天時，aFGF脂質體中劑量組、陽性對照組、aFGF脂質體高劑量組、aFGF脂質體低劑量組的創面癒合率顯著性高於陰性對照組（P＜0.01）。另外，空白脂質體（基質）組的創面癒合率也較陰性對照組有顯著性差異（P＜0.05）；④燙傷後第24天時，給藥組創面癒合基本完全，僅有陰性對照組創面尚未全愈。aFGF脂質體中劑量組、aFGF脂質體高劑量組和aFGF原液（陽性對照）組的創面癒合率顯著性高於陰性對照組（P＜0.05），aFGF脂質體中劑量組的創面癒合率顯著性高於空白脂質體（基質）組（P＜0.05）。

榮譽表彰

2018年12月20日，《一種aFGF脂質體、製備方法及其套用》獲得第二十屆中國專利獎優秀獎。