Touchdown PCR是指每隔一個循環降低1°C或者是0.5°C反應退火溫度，直至達到“Touchdown”退火溫度，然後以此退火溫度進行10個左右的循環。該方法最初出現是為了避開確定最佳退火溫度而進行的複雜的反應最佳化過程。正確和非正確退火溫度之間的任何差異將造成每個循環PCR產物量的兩倍差異（每攝氏度造成4倍差異）。因此相對於非正確產物，正確的產物可以得到富集。該方法的另一個套用是在確定已知序列肽的DNA序列。具體過程如下：使用兩套與已知序列肽兩末端可能配對的簡併引物，這只需要知道一段長為13個胺基酸的肽段序列，5’和3’引物各長18個鹼基（6個胺基酸），兩者之間有一個鹼基以上的間隔。
基本介紹
- 中文名：touch down PCR
- 條件：每隔一個循環
- 意義：退火溫度
- 方式：進行10個左右的循環
使用簡併引物即可以進行“Touchdown PCR”。由這種方法將獲得大量的產物，但因為由肽序列可以知道引物之間的確切距離，所以可以根據產物的大小來選擇所需要的產物。該方法的優點在於可以富集引物與模板正確配對的產物。如果克隆和測序一打PCR產物，將可以確定肽的正確編碼序列，設計進行雜交的寡核苷酸等。該技術特別適用於由Ser，Lys和Arg（每個有6個密碼子）構成的多肽。用primer premier來計算引物Tm值，退火溫度設計為從Tm+5度降落至Tm-10度，每度2個cycle，最後在tm-10度上增加5-10個cycle.例：Tm為58度，則從63度降落到48度，每度2個cycles,最後在48度加5-10個cycles.
原理就在於，溫度的升高提高了PCR擴增的特異性，但也提高了引物結合的難度，降低了擴增的效率，因此一開始先用高溫擴增，保證擴增的嚴謹性，待目的基因的豐度上升後，降低擴增的溫度，提高擴增的效率（此時非特異的位點由於豐度低，無法和特異位點競爭）。
但是，退火溫度TOUCH DOWN無法改善擴增效率低的問題，一般用於在雜模板中提高擴增特異性。
降落PCR（touch down PCR）：指的是每一個（或n個）循環退火溫度逐步降低1度，直到達到一個較低的退火溫度，該溫度稱為：“touchdown"退火溫度，然後在該溫度下繼續循環10個左右循環。
退火溫度的起始溫度高於計算的Tm15度左右，在接下來的循環中，退火溫度每個循環降低1－2度（一般為1度），直到低於Tm5度。
該策略的目的在於確保第一個引物－模板雜交事件發生在最互補的反應物之間，即特異性擴增的反應物之間，當退火溫度降低到非特異性擴增發生的水平時，特異產物在此時已經有一個幾何數的起始優勢，在剩餘的反應中，特異產物會競爭非特異產物，特異產物始終優先擴增，從而產生單一的占主導地位的擴增產物。
該方法主要用於避免非特異性PCR產物的出現，尤其是當使用複雜的基因組DNA模板，非特異性退火易發生時。
例子：
94度預變性3分鐘，
94度變性30秒，65度（Tm若為55度）退火30秒，72度延伸1分鐘。
以後每個循環依次降低1度，直到50度，共15個循環。
94度變性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分鐘。15－20個循環。
72度延伸10分鐘。
