Tm值

影響因素

（1）G—C的含量：在一定條件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所決定。G-C含量高時，Tm值比較高，反之則低。這是因為G-C之間的氫鍵較A-T多，解鏈時需要較多的能量之故。Tm值和G-C的含量可用二一個經驗公式表示：

（G—C）%=（Tm-69.3）×2.44

在一定條件下（pH7.0，0.165MNaCl中）Tm值與（GC）%含量呈正比關係。因此，通過測定Tm值，可以推算出DNA分子中的鹼基百分組成。

（2）DNA所處的溶液條件：DNA溶液中離子強度低時，Tm較低，而且熔解溫度範圍較寬；離子強度較高時，Tm較高，熔解溫度範圍較窄。因此，在表示某一來源DNA的Tm值時，必須指出其測定條件。

測定原理

雙鏈DNA在熱變性時吸光度的增高是溫度的函式，以相對吸光度為縱坐標，溫度為橫坐標作圖，查得吸光度增加專時的溫度，即為了Tm。

材料和試劑

小牛胸腺DNA，溶於0.1XSSC緩衝液中。

儀器

UV—365型紫外—可見—近紅外雙光束分光光度計，帶有SPR—8程式升溫儀。

測定步驟

1．以260nm測定DNA的吸光度，按50ug/ml時A=1.00計算DNA的濃度。

2．關於樣品的配製，其總容積為3ml，加入DNA的量為60ug左右；吸光度在0.3—0.4之間，再加10XSSC溶液，使待測液的緩衝液最終濃度為1XSSC。

3．以lXSSC為參比溶液，將參比杯和樣品杯加蓋密封，並在比色杯的兩側塗以矽油，樣品杯放入前槽，參比杯放入後槽，將熱電耦插入樣品蓋的金屬管內，然後測定。

4．在25℃測定A₂₆₀、A₂₈₀、A₂₃₀、A₂₆₀/A₂₈₀應在1。75—1。85之間，A₂₃₀/A₂₆₀應在0.5—0.6之間。

5．按下SPR—8程式升溫儀的RUN鍵，分8步自動控制升溫，在75℃後，每升高1℃記錄一次吸光度值，一直到94℃吸光度不再變化為止。

數據處理與計算

將記錄的溫度和相應的吸光度整理成表，將各吸光度乘以相應溫度的相對膨脹體積（V_T/V₂₅），以校正成相當於25℃水溶液體積的吸光度。用校正後的各吸光度除以25℃的吸光度，得出各個溫度的相對吸光度。

用各個溫度和相對應的相對吸光度繪製DNA熱變性曲線，熱變性曲線的中點對應的溫度為Tm值。