降落PCR

降落PCR，設計多循環反應的程式，以使相連循環的退火溫度越來越低。由於開始時的退火溫度選擇為高於估計的Tm值，隨著循環的進行，退火溫度逐漸降到Tm值，並最終低於這個水平，用於確保第一個引物—模板雜交事件發生在最互補的反應物之間，即那些產生目的擴增產物的反應物之間。

基本介紹

• 中文名：降落PCR
• 外文名：touchdown PCR
• 主要用於：PCR的條件的最佳化
• 影響因素：退火溫度過高

簡介

降落PCR（touchdown PCR），一種PCR技術，主要用於PCR的條件的最佳化。在許多情況下引物的設計使得PCR難以進行，例如特異性不夠易錯配等。退火溫度過高會使PCR效率過低，但退火溫度過低則會使非特異擴增過多。這雖然可以通過反覆嘗試來最佳化，但費時費力。降落PCR提供了一個較為簡易的最佳化方法。其原理大致是這樣的。首先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴增會逐步增多。但由於此時特異的擴增產物已經達到一定的數量優勢，因此會對非特異擴增產生強烈的競爭抑制，從而大幅提高PCR的特異性和效率。這一PCR技術已經大量地進入醫療臨床套用。時下，以高通量PCR為基礎的檢測方法、如人的 HLA分型 大多採用這一技術。

設計多循環反應的程式，以使相連循環的退火溫度越來越低。由於開始時的退火溫度選擇為高於估計的Tm值，隨著循環的進行，退火溫度逐漸降到Tm值，並最終低於這個水平，用於確保第一個引物—模板雜交事件發生在最互補的反應物之間，即那些產生目的擴增產物的反應物之間。儘管退火溫度最終會降到非特異雜交的Tm值，但此時目的擴增產物已開始幾何擴增，在剩下的循環中處於超過任何滯後（非特異）PCR產物的地位。

注意事項

由於目標是在較早的循環中避免低Tm值配對，在TD—PCR中最好套用熱啟動技術。設計時，退火溫度的範圍應跨越15℃左右，從高於估計Tm值至少幾度到低於它10℃。

例：一對沒有簡併的引物—模板的計算Tm值為62℃。

則：從65℃—>50℃（每2cycles降退火溫度1℃），再在50℃退火溫度下做15個循環。

實驗中如持續出現假象帶（雜帶），則是因為起始退火溫度太低，或目的擴增產物和非目的產物的Tm值相差無幾，或非目的擴增物以更高的擴增效率擴增，可把退火溫度每降低1℃所需的循環數增加到3或4。