RACE技術

近年來隨著生物技術的不斷發展，出現了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術、轉座子標籤技術、mRNA差異顯示技術、基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法大多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一種基於PCR從低豐度的轉錄本中快速擴增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其簡單、快速、廉價等優勢而受到越來越多的重視。

基本介紹

  • 中文名：RACE技術
  • 外文名：rapid amplification of cDNA end
  • 全稱：cDNA末端快速擴增技術
  • 縮寫：RACE
RACE技術的歷史,技術原理,目前遇到的問題及解決方法,

RACE技術的歷史

經典的RACE技術是由Frohman等（1988）發明的一項技術，主要通過RT-PCR技術由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA 5' 和3' 端，包括單邊PCR和錨定PCR。該技術提出以來經過不斷發展和完善，克服了早期技術步驟多、時間長、特異性差的缺點（Frohm等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等1999）。
對傳統RACE技術的改進主要是引物設計及RT-PCR技術的改進：
改進之一是利用鎖定引物（lock docking primer）合成第一鏈cDNA，即在oligo(dT)引物的3' 端引入兩個簡併的核苷酸[5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始點，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位的結合所帶來的影響；
改進之二是在5' 端加尾時，採用poly(C)，而不是poly(A)；
改進之三是採用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反轉錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫（60℃~70℃）有效地逆轉錄mRNA，從而消除了5' 端由於高CC含量導致的mRNA 二級結構對逆轉錄的影響；
改進之四是採用熱啟動PCR （hot start PCR）技術和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反應的特異性。
隨著RACE技術日益完善，目前己有商業化RACE技術產品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術和SMARTTM RACE技術。邢桂春等（2001）先後使用上述兩種試劑盒進行RACE反應，結果發現使用MarathonTM所得到的片斷總是比採用SMARTTM RACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在於MarathonTM技術反轉錄反應往往不能真正達到mRNA的5' 末端。所以認為，進行RACE反應應當優選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國內目前套用最廣的SMARTTM RACE試劑盒為例，簡要概述RACE技術的原理和操作過程。

技術原理

SMARTTM 3'-RACE原理
利用mRNA的3' 末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉錄合成標準第一鏈cDNA。然後用一個基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環，把目的基因3' 末端的DNA片段擴增出來。（見下圖）
RACE技術
SMARTTM 5'-RACE原理
先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以Oligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成標準第一鏈cDNA。利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到第一鏈的5' 末端時自動加上3-5個(dC)殘基，退火後(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接頭引物配對後，轉換為以SMART序列為模板繼續延伸而連上通用接頭（見下圖）。然後用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為上游引物，用一個基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進行PCR循環，把目的基因5'末端的cDNA片段擴增出來。
RACE技術
最終，從2個有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產物的3'和5'端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。

目前遇到的問題及解決方法

實驗中發現，做RACE反應實驗實際操作中仍存在不少困難。因此，對RACE反應條件進行反覆摸索是十分必要的。這是因為：
1. 在5'-RACE包含了有3個連續的酶反應步驟（反轉錄、同聚物加尾和PCR擴增），每一步都可能導致失敗；
2. 擴增DNA末端的特異性完全依賴錨定引物及擴增DNA模板樣品的不均一性，因而特異性一般很低，常呈現不清晰的成片條帶或截短的產物背景。因此，使用RACE技術擴增得到的特異末端片段，所獲得的重組克隆最好能夠全部測序，以排除RACE實驗結果中擴增產物假陽性和假陰性，最終有可能獲得新基因的全序列。
隨著RACE的不斷改進和完善，最佳化條件下PCR擴增效率和忠實性的提高及PCR產物克隆技術的迅速發展，RACE必將在基因克隆及基因表達研究中發揮越來越大的作用。
RACE的另一種代表方法-Self-Ligation法
反轉錄(RT)反應------Hybrid RNA的分解------單鏈cDNA的自身連線------PCR擴增5'未知區域------目的DNA片段的切膠回收------DNA序列測定

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