《PDE10A對特發性肺纖維化的調控及其分子機制研究》是依託浙江大學，由史建蓉擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：PDE10A對特發性肺纖維化的調控及其分子機制研究
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：史建蓉
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
特發性肺纖維化（IPF）是一種嚴重的慢性發展致死性的肺疾病。目前尚無有效治療方法。磷酸二酯酶10（PDE10）是具有雙底物特性的PDE亞型。已有IPF病人基因資料庫信息提示PDE10A表達明顯上調。本研究小組的預實驗也證實PDE10A在小鼠博萊黴素誘導的肺纖維化進程中表達明顯增加，其特異性抑制劑罌粟鹼能明顯抑制此肺纖維化進程。由此，我們推測PDE10A可能是一個新的IPF相關調控基因。本研究擬採用博萊黴素誘導的小鼠肺纖維化模型及通過培養肺組織結構細胞，採用免疫組化、WB、免疫沉澱、siRNA、TGF-β轉化及PDE10抑制劑干預等方法，分析PDE10A在肺部的表達與分布及其在EMT、平滑肌增殖中的作用和相關信號通路；進一步通過PDE10A基因敲除小鼠進行驗證，從而闡明PDE10A對肺纖維化的調控及分子機制。這不僅為肺纖維化的機制研究提供新的視點，同時對IPF新藥的研製和開發也具有指導意義。
結題摘要
研究背景：我們的初步研究發現PDE10A的表達量在博來黴素誘導的肺纖維化中明顯增加，因此，我們通過體外和體內實驗探討抑制PDE10A表達的罌粟鹼對於肺纖維化的治療作用。 研究方法：在體外實驗中，我們採用TGF-β1來處理不同的成纖維細胞建立成纖維細胞-肌成纖維細胞轉化的體外細胞模型：分別給與罌粟鹼和吡非尼酮30min後，再給與TGF-β1誘導48h。檢測成纖維細胞肌化表型標誌物（如α-SMA，I型膠原，纖維連線蛋白）的表達。再通過免疫印跡明確其抗纖維化的相關機制。在體內實驗中，通過博萊黴素氣道滴注C57BL/6N小鼠來誘導肺纖維化模型。分別從第1天到14天以及從第7天到21天腹腔注射PDE10A抑制劑罌粟鹼。通過masson三色染色法來檢測膠原沉積。通過組織免疫螢光法檢測α-SMA的表達含量以及位置來闡述罌粟鹼的靶標細胞以及相應的效應，檢測經典的纖維化細胞信號通路如p-smad2/3,-catenin通路蛋白確認具體作用途徑。研究結果：體外研究中，實時定量PCR確認TGF-β1誘導的成纖維細胞的肌化在48h最明顯；在人肺成纖維細胞HFL-1和 MRC-5中，通過免疫螢光檢測肌化指標α-SMA，提示罌粟鹼（100M）能顯著抑制由TGF-β1誘導的成纖維細胞的肌化如α-SMA，I型膠原和纖維連線蛋白的增加，而同等劑量的吡非尼酮沒有效果，且罌粟鹼處理能明顯降低由TGF-β1誘導的-catenin表達含量的增加，且並非是通過減少-catenin的核轉移而是減少了在胞漿內的表達含量；同時罌粟鹼對經典的TGF-β1通路中的磷酸化的smad2/3沒有影響。另外，在胚胎小鼠中分離的成纖維細胞MEF中，通過免疫螢光與WB再一次確認了罌粟鹼對肌成纖維細胞活化的抑制作用。在體內實驗中，通過masson三色染色實驗，結果顯示在預防組與治療組採用腹腔注射罌粟鹼（10mg/kg）後均能明顯抑制由博來黴素（2.5mg/kg）誘導的肺間質上纖維膠原的積聚。另外，組織免疫螢光結果顯示罌粟鹼能明顯減少在肺間質細胞中博來黴素誘導的a-SMA的增加以及通路分子-catenin的表達。研究結論：本研究的結果提示罌粟鹼能抑制由TGF-β1誘導的肌成纖維細胞活化以及減弱由博來黴素誘導的肺纖維化。提示了罌粟鹼抑制纖維化具有一定的前景，而且機制可能涉及 TGF-β1/-catenin通路。
