MALDI-TOF-MS（基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜, 英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）是近年來發展起來的一種新型的軟電離生物質譜，其無論是在理論上還是在設計上都是十分簡單和高效的。
基本介紹
- 中文名：基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜
- 外文名：Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
- 簡寫：MALDI-TOF-MS
- 領域：化學
背景引言,基本原理,關鍵因素,套用,
背景引言
電噴霧電離 ( ESI ), 基質輔助雷射解吸電離( MALDI） 技術, 和飛行時間質量分析器的出現為分析合成高分子提供了良好的工具。1988 年,Tanaka 等人 率先報導以含有金屬微粒的甘油為基質測定了分子量高達 22,00Da 的聚乙二 醇( PEG ) 的分子量分布, 接著,Dains 等人 報導用標準的 MALDI 樣品製備方法測定工業高分子聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸, 後者分子量在30000 Da 以上 ; 基質輔助雷射解吸離子化技術的發明者 Karas M.和 Hillenkamp F.於 1992年報導 用 MALDI一TOF 測定聚苯乙烯分子量達 70KDa,PEG 分子量達 40 KDa, 其結果 與GPC 方法基本一致,經過短短几年的發展, 直至1996 年為止, 對 PS 的可測分子量上限已達1500 KDa 。
基於MALDI-TOF生物質譜的組織成像技術 （MALDI-imaging mass spectrometry ，MALDI-IMS）是一門新興的分子成像技術，對於發現疾病生物標誌物和研究藥物代謝等方面具有重要意義，並具有良好的臨床套用前景。MALDI-TOF-MS近期的發展主要在改善靈敏度，提高解析度，擴大套用範圍以及標誌物的鑑定等方面。靈敏度和解析度主要受雷射器頻率和能量，樣本切片質量，基質噴塗效果等因素影響。高頻率（200Hz和1000Hz）的固體雷射器已經普遍用於MALDI質譜中，可在較短時間內完成一個切片的成像質譜數據採集，但可調光束直徑的雷射器對於IMS更有利。切片質量和基質覆蓋一直是IMS的一個技術瓶頸.近年來,一些研究者和質譜公司開發了新型基質噴塗設備和技術,改善了切片前處理方法,大大提高了質譜成像技術的靈敏度和解析度。
基本原理
儀器（如圖1）主要由兩部分組成：基質輔助雷射解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質量分析器（TOF）。MALDI的原理是用雷射照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從雷射中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術，適用於混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比 ，檢測離子。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高及解析度高等特點，為生命科學等領域提供了一種強有力的分析測試手段，並正扮演著越來越重要的作用。
圖1 MALDI-TOF MS儀器結構框圖
圖1 MALDI-TOF MS儀器結構框圖早期的MALDI一TOF 儘管能夠分析質量數達數萬的大分子, 但是它只有數百的解析度,質譜峰較寬,信噪 比不理想, 質量測量精度不高。對於 MALDI一TOF, 影響解析度的主要因素是初始離子的動能分散。 這已在 Chait 等人的實驗中得到證實 。目前主要有兩個措施來解決這個問 題: ① 靜電反射器 ( ElectrostaticReflec tron), 這個概念最早由 Manlyrin 於 1973 年提出,其基本原理是當離子源飛向反射器時.高動能的離子會比低動能的離子更深的穿入反射器。 離子被反射後, 飛抵離子檢測器, 高動能的離子飛行的路程就長一 些。 調節反射器條件就可以使得質量相同而初始動能不同的離子更加一致地達到檢測器, 實現動能的一級聚焦。Mamyrin於 1994 年 又提出了對離子進行高次聚集的設計方案。Cotetr 用十分簡 單的圓筒電極作為反射器實現了 Mamyrin 的構想 。反射器可以使MALDI 一TOF 的解析度大大提高。②離子延遲引出 ( Delay Extraction) , 當雷射照射靶的瞬間, 若靶電極和與其相對的離子引出電極處於相同的電位, 即在兩電極之間形成無場區, 那么被解吸離子以不同的初始速度在無場區內運動, 經過一 段延遲時間後, 速度高的離子離靶遠,速度低的離子離靶近, 然後以脈衝方式在瞬間使靶與引出電極處於不同電位, 由此產生的電場把離子引出, 經聚焦透鏡後飛出離子源。 離靶近的離子比離靶遠的離子得到更大的加速 ( 因而獲得更大的動能 ), 適當選擇延遲時間及靶與引出電極間電壓差, 可以有效地補償離子的初始動能分散, 從而顯著地提高線性 TOF 質譜儀的解析度, 飛行距離約 1 m 的線性TOF質譜儀的解析度可達 2000-3000。 這一技術即為 “延遲引出” （Delay Extraction) 技術或稱為“ 脈衝離子引出”( PulseIon Extraction, PIE )。 延遲引出技術與離子反射器聯合用可使 MALDI一TOF 質譜儀的解析度超過一 萬。
關鍵因素
對於基質 、溶劑、 鹽 ( 金屬離子 ) 和樣品製備方法的選擇是 MALDI 分析高聚物成敗的關鍵因素。 最最佳化的條件是使樣品分子和基質均勻地形成共結晶, 在分析合成高分子時, 要達到這個目的並不容易。
基質及其作用
MALDI方法分析大分子, 重要的關鍵之一是選擇合適的基質。結果表明, 效果較佳的基質只有幾種 。
水溶性合成高分子如聚乙二醇 ( PEG） 、聚丙二醇經常出現於早期的 MALDI 研究中, 這是因為分析多肽的基質也可以套用於它們, 對於另外一些高分子, 可以從高分子和基質的溶解性中找到一些選擇基質的思路。一般來說, 選擇基質時應使基質與高分子的極性比較一致, 彼此之間具有兼容性。 然而, 選擇最佳基質仍然是一個嘗 試的過程。
在高分子分析中的陽離子化
與 MALDI 分析生物分子相比,合成高分子的離子化在多數情況下是金屬離子陽離子化而不是質子化。 因此, 僅僅最佳化基質是不夠的。 而應該與金屬離子同時考慮。 對於相對於極性較大的高分子, 在 MALDI 分析中一般 是鉀離子化或鈉離子化。
樣品製備技術
使用一個特定的樣品製備方法時, 必須先選擇適用於基質、 樣品 和陽離子化鹽的溶劑。 最理想的情況是使用一種溶劑。 這樣可以減少樣品在靶上結晶時分層的危險。 然而, 鹽類幾乎不溶於用於非極性合成高分子的有機溶劑。 一般來講, 鹽可以先溶於一個中間溶劑如丙醇中, 然後再用於基質和樣品的溶劑稀釋。 製備樣品時, 應選擇適當的溶劑、合適的濃度及配比, 才能獲得較好的結果。
套用
分子量測定
分子量是有機化合物最基本的理化性質參數【35】。分子量正確與否往往代表著所測定的有機化合物及生物大分子的結構正確與否。MALDI-TOF是一種軟電離技術，不產生或產生較少的碎片離子。它可直接套用於混合物的分析，也可用來檢測樣品中是否含有雜質及雜質的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白質等鑑定中首要的參數，也是基因工程產品報批的重要數據之一。MALDI-TOF的準確度高達0.1%~0.01%，遠遠高於目前常規套用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術，目前可測定生物大分子的分子量高達600KDa。
圖2 MALDI-TOF法與GPC法所測分子量比較
圖2 MALDI-TOF法與GPC法所測分子量比較質譜技術PMF
蛋白質組學是當前生命科學研究的前沿領域。對蛋白質快速、準確的鑑定是蛋白質組學研究中必不可少的關鍵性的一步。採用MALDI-TOF-MS測得肽質量指紋譜（PMF）在資料庫中查詢識別的方式鑑定蛋白質，是目前蛋白質組學研究中最普遍套用的最主要的鑑定方法。肽質量指紋譜（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）是蛋白質被識別特異酶切位點的蛋白酶水解後得到的肽片段的質量圖譜。由於每種蛋白的胺基酸序列（一級結構）都不同，當蛋白被水解後，產生的肽片段序列也各不相同，因此其肽質量指紋圖也具有特徵性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物時，能耐受適量的緩衝劑、鹽，而且各個肽片幾乎都只產生單電荷離子，因此MALDI-TOF成為進行分析PMF的首選方法。在我們關於蛋白質組學研究的實際工作中，幾乎所有的發現均是從這一步開始做起來的！
圖3 PS2，800的MALDI-TOF質譜圖
圖3 PS2，800的MALDI-TOF質譜圖質譜技術PSD
由於PMF鑑定結果的可靠性受諸多因素影響，使得部分鑑定結果往往不是十分明確，特異性不高。多肽胺基酸序列匹配被認為是特異性最好的鑑定方法。在蛋白質組學研究中，利用質譜測序一般採用兩種方式：一種是利用串聯質譜（MS/MS）測序；另一種是利用源後衰變（post-source decay，PSD）技術測序。
在反射式MALDI-TOF-MS中，當脈衝雷射照射到微量樣品與飽和小分子基質混合形成的共結晶上時，能量通過基質傳遞給樣品，導致樣品被解析電離，電離後形成的亞穩分子離子在飛經無場區（即飛行管區）時發生裂解（其活化能來自在離子源與基體發生的碰撞，在無場區與殘留氣體的碰撞，雷射輻射及各種熱機制等）所產生的子離子（即源後分解碎片離子），可以通過不斷改變反射器電壓來進行分離、收集並記錄於檢測器，形成能為多肽和蛋白質一級結構提供十分豐富而有效的結構信息的PSD質譜圖。利用PSD譜圖，結合資料庫檢索可以迅速、高特異性地鑑定蛋白質。
目前，在蛋白質組學研究中，部分經2DE分離的蛋白質樣品無法通過PMF鑑定或鑑定結果不明確，可將PSD測序功能套用於這些蛋白質的鑑定。隨著對PSD技術的不斷研究和發展，尤其是結合MALDI-TOF-MS本身所具有的高靈敏度、高通量、樣品靶點可多次套用測定、分析時主要產生單電荷準分子離子以及能夠耐受一定量的鹽和干擾物等特點，PSD-MALDI-TOF-MS將會在蛋白質組學、代謝組學以及藥物篩選的研究中發揮更大的作用。
寡核苷酸的分析
