基本介紹
簡介,使用方法,濃度範圍,質量指標,篩選,商業信息,
簡介
G418通過干擾核糖體的功能而阻斷細胞的蛋白合成
使用方法
室溫下運輸, 乾粉在室溫下儲存，溶於水、甲醇，溶液於-20℃儲存 由於各真核細胞系對G418敏感度不同,各新細胞系或株穩定轉染時殺死非穩定轉染細胞所需用量需要通過實驗最佳化。最適用量通過建立細胞死亡曲線獲得。將細胞稀釋至1000cell/ml，每孔100ul加入有培養基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等12個級別, 培養10-14天，以細胞全部死亡最低濃度為基準，一般400-800左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持時使用篩選濃度的一半即可。
濃度範圍
細胞系或機體 G418濃度（ug/ml）
中國倉鼠卵巢細胞700～800
Madin－Darby犬腎細胞 500
人上皮A431細胞 400
猿CV-1細胞 500
盤基網柄菌屬 10～35
植物 10
酵母125～500
質量指標
G418 ：白色粉末，融點138～144℃，溶於水、甲醇。 CAS No.：108321-42-2
分子式 ：C20H40N4O10 ?2H2SO4 分子量 ：692.71
比旋：+104o～+121o 水分：≤10% 吸光值：≤0.015 (280nm,1mg/ml), ≤0.1 (570nm, 100mg/ml)
效價： >700 ug/mg
[儲運]室溫下運輸, 乾粉在室溫下儲存，溶液於-20℃儲存。
篩選
由於每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度範圍內進行篩選，選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。
由於每種細胞對G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml～1000ug/ml範圍。在篩選之前，一定要確定細胞對這一批G418的最佳篩選濃度。儘管如此，特性明確的細胞系G418的最佳用量還是穩定的。《分子克隆》給出了幾個常用細胞系所需G418的最佳用量。
加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題：1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細胞數目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液：假如你要轉染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養過夜之後收集培養液，通過濾器消毒，和新鮮的培養液按1：1混合備用。再轉染後篩選過程中就可以套用這種培養基。
為了儘量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以套用套環法或刮除法結合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥後，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認，在陽性克隆下用記號筆做個標記。然後刮除陰性克隆，消化陽性克隆後繼續篩選培養；或者用套環套住陽性克隆，在套環內加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養。最後再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。
一般經過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的機率太小了，而且是隨機整合，會導致表達的目的蛋白的量產生很大差異。隨著培養時間的延續，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據優勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經過2次以上的篩選之後才能找到那種我們想要的強分泌目的蛋白的，遺傳穩定的細胞克隆。
商業信息
產品規格：1g原裝
產品貨號：1758-1811
產品價格：￥510.00
所屬分類：抗生素
所屬廠家：INALCO
產品說明： G418 Sulfate （也稱Geneticin）
CAS：108321-42-2
分子式：C20H40N4O10.2H2SO4
分子量：692.7
外觀：白色，乳白色粉末
純度：>；=700ug/mg
pH：5.0-7.0（0.1%in H2O ）
溶解性：清澈溶液（100mg/ml in H2O）
儲存： 4℃保存2年
