基本介紹
形成原理,套用,1、配液：,2、操作步驟（方法一）：,(3)DNA-磷酸鈣沉澱物的製備：,(4)轉染受體細胞：,3、基因組DNA轉染（方法二）：,
形成原理
核酸以磷酸鈣-DNA共沉澱物的形成出現時，可使DNA黏附在細胞表面，利於細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，進入細胞的DNA僅有1%-5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩定表達，基因轉導的頻率大約為10，這項技術能用於任何DNA導入哺乳動物細胞進行暫時性表達或長期轉化的研究。
套用
此方法對於貼壁細胞轉染是最常用並首選的方法。
1、配液：
2× HBS1.63gNaCl；1.19g Hepes；0.023gNa2PO4.2H2O；加水至100ml（pH7.1），過濾，<4℃保存。
2mmol/L CaCl2過濾除菌。
TE 0.1mmol/LEDTA；1mmol/LTris-HCl(pH 8.0).
G418（新黴素G418）液1g G418溶於1mmol/L Hepes緩衝液中，加水至10ml，過濾除菌，<4℃保存。
G418選擇性培養基用含10%胎牛血清的DMEM培養基配製，G418濃度為200-800mg/L。
注意對受體細胞先做預實驗，選用在10-14天內能殺死細胞50%以上的最低濃度。
2mmol/L CaCl2過濾除菌。
TE 0.1mmol/LEDTA；1mmol/LTris-HCl(pH 8.0).
G418（新黴素G418）液1g G418溶於1mmol/L Hepes緩衝液中，加水至10ml，過濾除菌，<4℃保存。
G418選擇性培養基用含10%胎牛血清的DMEM培養基配製，G418濃度為200-800mg/L。
注意對受體細胞先做預實驗，選用在10-14天內能殺死細胞50%以上的最低濃度。
2、操作步驟（方法一）：
（1）供體DNA製備：按前介紹的DNA提取法提取DNA，溶於TE中，40mg/L。
(2)受體細胞的培養：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH-3T3細胞系等，該細胞有一定自發轉化傾向，一般在轉染前1天接種細胞，接種密度為2×10個/cm，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5% CO2培養，待細胞占50%-70%瓶底面積時，用於轉染試驗。
(2)受體細胞的培養：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH-3T3細胞系等，該細胞有一定自發轉化傾向，一般在轉染前1天接種細胞，接種密度為2×10個/cm，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5% CO2培養，待細胞占50%-70%瓶底面積時，用於轉染試驗。
(3)DNA-磷酸鈣沉澱物的製備：
將供體細胞DNA和PSV-2neo質粒載體DNA用TE配製成40mg/L的DNA溶液，同時想供體細胞DNA溶液200ul中加入新黴素基因的質粒DNA溶液（20mg/L）220ul和2 x HBS 250ul（PSV2-neo為1-2mg/L）。
取500ul上述DNA溶液加入矽化試管中，緩慢加入3.1ml CaCl2(2mol/L)混勻30s。
然後立即混旋，室溫下靜置30min，待溶液輕度渾濁後，吹打後即用於轉染受體細胞。
取500ul上述DNA溶液加入矽化試管中，緩慢加入3.1ml CaCl2(2mol/L)混勻30s。
然後立即混旋，室溫下靜置30min，待溶液輕度渾濁後，吹打後即用於轉染受體細胞。
(4)轉染受體細胞：
將處於對數生長期已占瓶底50%-70%的受體細胞在轉染前4h更換一次新鮮培養基，每瓶5ml（25ml培養瓶）。
吸取0.5DNA-磷酸鈣沉澱，加入含5ml培養基的細胞瓶中搖勻。
置37℃、5% CO2培養24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結晶顆粒。
更換新鮮培養基，繼續培養24h，誘導轉染基因的表達。
更換濃度為800mg/L的G418選擇培養基進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。
培養大約3-5天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養基，每3-4天更換一次選擇培養基。
2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現，待其增大後再進行克隆化和擴大培養。可建立轉化細胞株，並作進一步鑑定。
本實驗要加入PSV-neo、DNA於外源DNA共轉染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得新黴素（neo）基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現明顯的“轉化灶”，也可測出轉入的外源性基因的抗新黴素的標記。而且還可利用被新黴素基因導入的受體細胞通過G418選擇性培養基篩選轉化的細胞建立細胞株。Uoyi獲取“轉化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA，只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導入受體細胞即可，方法如下。
吸取0.5DNA-磷酸鈣沉澱，加入含5ml培養基的細胞瓶中搖勻。
置37℃、5% CO2培養24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結晶顆粒。
更換新鮮培養基，繼續培養24h，誘導轉染基因的表達。
更換濃度為800mg/L的G418選擇培養基進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。
培養大約3-5天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養基，每3-4天更換一次選擇培養基。
2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現，待其增大後再進行克隆化和擴大培養。可建立轉化細胞株，並作進一步鑑定。
本實驗要加入PSV-neo、DNA於外源DNA共轉染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得新黴素（neo）基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現明顯的“轉化灶”，也可測出轉入的外源性基因的抗新黴素的標記。而且還可利用被新黴素基因導入的受體細胞通過G418選擇性培養基篩選轉化的細胞建立細胞株。Uoyi獲取“轉化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA，只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導入受體細胞即可，方法如下。
3、基因組DNA轉染（方法二）：
配製磷酸轉染。NaCl 8.0g，Hepes5.0g；Na2HPO40.099g；加溫水至1000ml。用時現配，pH很重要，一定要控制在6.95±0.65，消毒滅菌，-20℃貯存備用。
按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。
取供體基因DNA50-100ug，加3mmol/L NaCl或醋酸鈉，使最終濃度至0.3mmol/L，混勻。
再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10min，棄上清。
加入轉染緩衝液，待DNA充分融解後，夾在如2.5mmol/L CaCl2，終濃度為125mmol/L，用吸管吹打3次，置室溫下10-30min，待液體透明度降低，出現微濁藍色時，即可用於轉染細胞。
取生長狀態良好處於半匯合階段的對數生長期細胞，在轉染前4h，更新培養基一次。
轉染。向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉澱物0.5-1ml，置37℃作用4-6h。
培養。棄去培養基，用15%甘油處理3min，無血清培養基漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%，培養2-3周。
檢測。逐日觀察，待出現“轉化灶”後，克隆分離，擴大培養建立轉化細胞株。
按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。
取供體基因DNA50-100ug，加3mmol/L NaCl或醋酸鈉，使最終濃度至0.3mmol/L，混勻。
再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10min，棄上清。
加入轉染緩衝液，待DNA充分融解後，夾在如2.5mmol/L CaCl2，終濃度為125mmol/L，用吸管吹打3次，置室溫下10-30min，待液體透明度降低，出現微濁藍色時，即可用於轉染細胞。
取生長狀態良好處於半匯合階段的對數生長期細胞，在轉染前4h，更新培養基一次。
轉染。向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉澱物0.5-1ml，置37℃作用4-6h。
培養。棄去培養基，用15%甘油處理3min，無血清培養基漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%，培養2-3周。
檢測。逐日觀察，待出現“轉化灶”後，克隆分離，擴大培養建立轉化細胞株。
