聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時內複製出上百萬份的DNA拷貝。
基本介紹
- 中文名：DNA聚合酶鏈式反應
- 外文名：PCR
- 作用於：DNA
- 作用催化劑：聚合酶
- 反應類型：鏈式反應
- 發現時間：1955年
- 範疇：生物
概述,〔PCR原理〕,〔PCR步驟〕,〔PCR檢測〕,PS:,
概述
這項技術有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題，被廣泛地套用於遺傳疾病的診斷、刑偵破案、基因克隆和DNA序列測定等各方面。
DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早於1955年發現 ，而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E. Coli 則是於60年代的初期由Dr. H. Klenow 所發現，但由於此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現今所使用的酶(簡稱 Taq polymerase), 則是美國微生物學家布魯克（T.Brook）於1966年從美國黃石國家公園溫泉中的細菌（Thermus aquaticus）分離出來的。因為熱泉70-80攝氏度的高溫條件淘汰了絕大多數微生物，是耐熱的Taq酶脫穎而出。它的特性就在於能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運用則於80年代之後。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復複製，它是於1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發表了第一個單純且短暫性基因複製（類似PCR前兩個周期反應）的實驗。而現今所發展出來的PCR則於1983由 Dr. Kary B. Mullis發展出的，Dr. Mullis當年服務於PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 並於1985年與 Saiki 等人正式表了第一篇相關的論文。此後，PCR的運用一日千里，相關的論文發表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨後PCR技術在生物科研和臨床套用中得以廣泛套用，成為分子生物學研究的最重要技術。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。
〔PCR原理〕
DNA的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發現，DNA在高溫時由於兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復形成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，並設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外複製。
但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的套用和發展。
發現耐熱DNA聚契約酶--Taq酶對於PCR的套用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量套用，並逐步套用於臨床。
〔PCR步驟〕
標準的PCR過程分為三步：
1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
2.復性（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳，也能在很短的時間內複製完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。
〔PCR檢測〕
PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。螢光素（溴乙錠）染色凝膠電泳是最最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以螢光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。
PS:
聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction ,PCR）
三步：
1 變性：模板DNA加熱變性
2 復性 引物與它的靶序列發生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成雜交鏈
3 延伸 4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下，DNA合成酶催化以引物為起始點，按5'-3'方向進行延伸。
上面三步為一個循環，可使拷貝數到達2*E－6-2*E－7
PCR 產物一段雙鏈DNA，是由它的末端引物的5’端決定的。
1.首輪擴增，其產物是大小不均一的DNA分子。長度應大於兩引物之間的長度。
在第二個循環中，如圖3，由於5'固定，其產物長度就由等於兩引物之間的長度。所以幾十個循環後就會產生大量的兩引物之間序列。
引物設計：
1，長度15~30個核苷酸，最多到50個核苷酸左右。（50？為什麼？反正太長也沒有必要）
2, 儘量避免嘌呤和嘧啶堆積的現象。（其實有時很難避免，不是很重要）。
3,引物內部不應該形成二級結構，如果引物中有酶切位點時，就會出現引物二聚體。（一般不是很重要）
PCR的反應條件
1，dNTP濃度過高會加快反應速度，但同時還可以增加鹼基的錯誤摻入率。
2， 引物濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增。
3，TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產物擴增，低則合成產物量減少。
TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達2*E-4個核苷酸，一個30個循環的擴增反應0.1%-0.25%總錯誤率。
4， 在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。
5，DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結合。引物長度在15～25時退火溫度
Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低；溫度高，不容易退火但特異性高。退火時間30秒。
6，延伸溫度一般在70～75度這時TaqDNA聚合酶活性最高（150個/S），當引物在16個鹼基以下時可採用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開始合成。一般<1KB時間1分鐘即可。當〈1KB時在較後的循環中延長擴增時間。
7：循環次數25～30次。
無產物時：
1，取10ul擴增混合液作模板在進行PCR擴增。
2，增加TaqDNA聚合酶濃度
3，增加循環次數
4，降低退火溫度
5，加靶DNA量
