DNA測序儀

DNA測序儀

DNA序列測定分手工測序和自動測序,手工測序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今 dna序列分析的主流。美國pe abi公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀,其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。

基本介紹

  • 中文名:DNA測序儀
  • 全稱:abi prism 310型基因分析儀
  • 屬性:高檔精密儀器
  • 公司:美國pe abi公司
原理,發展歷史,試劑器材,操作步驟,計算,注意事項,

原理

abi prism 310型基因分析儀(即dna測序儀),採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳,套用該公司專利的四色螢光染料標記的ddntp(標記終止物法),因此通過單引物pcr測序反應,生成的pcr產物則是相差1個鹼基的3''''末端為4種不同螢光染料的單鏈dna混合物,使得四種螢光染料的測序 pcr產物可在一根毛細管內電泳,從而避免了泳道間遷移率差異的影響,大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同,在毛細管電泳中的遷移率也不同,當其通過毛細管讀數視窗段時,雷射檢測器視窗中的ccd(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對螢光分子逐個進行檢測,激發的螢光經光柵分光,以區分代表不同鹼基信息的不同顏色的螢光,並在ccd攝影機上同步成像,分析軟體可自動將不同螢光轉變為dna序列,從而達到dna測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、螢光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。
它是一台能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定dna片段的鹼基順序或大小和定量的高檔精密儀器。pe公司還提供凝膠高分子聚合物,包括dna測序膠(pop 6)和genescan膠(pop 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一,避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、macintosh電腦、彩色印表機和電泳等附屬檔案組成。電腦中則包括資料收集,分析和儀器運行等軟體。它使用最新的ccd攝影機檢測器,使dna測序縮短至2.5h,pcr片段大小分析和定量分析為 10~40min。
由於該儀器具有dna測序,pcr片段大小分析和定量分析等功能,因此可進行dna測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(sscp)、微衛星序列分析、長片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析,臨床上可除進行常規dna測序外,還可進行單核苷酸多態性(snp)分析、基因突變檢測、hla配型、法醫學上的親子和個體鑑定、微生物與病毒的分型與鑑定等。

發展歷史

70年代末,WalterGilbert發明化學法、FrederickSanger發明雙脫氧終止法手動測序,同位素標記
80年代中期,出現自動測序儀(套用雙脫氧終止法原理)、螢光代替同位素,計算機圖象識別
90年代中期,測序儀重大改進、集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳
2001年完成人類基因組框架圖

試劑器材

1.bigdye測序反應試劑盒 主要試劑是bigdye mix,內含pe專利四色螢光標記的ddntp和普通dntp,amplitaq dna polymerase fs,反應緩衝液等。
2.pgem-3zf (+) 雙鏈dna對照模板 0.2g/l,試劑盒配套試劑。
3.m13(-21)引物 tgtaaaacgacggccagt,3.2μmol/l,即3.2pmol/μl,試劑盒配套試劑。
4.dna測序模板 可以是pcr產物、單鏈dna和質粒dna等。模板濃度應調整在pcr反應時取量1μl為宜。本實驗測定的質粒dna,濃度為0.2g/l,即200ng/μl。
5.引物 需根據所要測定的dna片段設計正向或反向引物,配製成3.2μmol/l,即3.2pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物,如m13(-21)引物,t7引物等。
6.滅菌去離子水三蒸水
7.0.2ml或和0.5ml的pcr管 蓋體分離,pe公司產品。
8.3mol/l 醋酸鈉(ph5.2) 稱取40.8g naac·3h2o溶於70ml蒸餾水中,冰醋酸調ph至5.2,定容至100ml,高壓滅菌後分裝。
9.70%乙醇和無水乙醇
10.naac/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/l naac混勻,室溫可保存1年。
11.pop 6測序膠 abi產品。
12.模板抑制試劑(tsr) abi產品。
13.10×電泳緩衝液 abi產品。
14.abi prism 310型全自動dna測序儀。
15.2400型或9600型pcr儀
16.台式冷凍高速離心機
17.台式高速離心機或袖珍離心機。

操作步驟

pcr測序反應
(1) 取0.2ml的pcr管,用記號筆編號,將管插在顆粒冰中,按下表加試劑:
所加試劑 測定模板管 標準對照管
bigdye mix 1μl 1μl
待測的質粒dna 1μl -
pgem-3zf (+) 雙鏈dna - 1μl
待測dna的正向引物 1μl -
m13(-21)引物 - 1μl
滅菌去離子水 2μl 2μl
總反應體積5μl,不加輕礦物油或石蠟油,蓋緊pcr管,用手指彈管混勻,稍離心。
(2) 將pcr管置於9600或2400型pcr儀上進行擴增。98℃變性2min後進行pcr循環,pcr循環參數為96℃ 10s,50℃ 5s,60℃4min,25個循環,擴增結束後設定4℃保溫。
醋酸鈉/乙醇法純化pcr產物
(1) 將混合物離心,將擴增產物轉移到1.5ml ep管中。
(2) 加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液,充分振盪,置冰上10min以沉澱dna。12 000r/min於4℃離心30 min,小心棄上清。
(3) 加70%(v/v)的乙醇50μl洗滌沉澱2次。12 000r/min於4℃離心5min,小心棄上清和管壁的液珠,真空乾燥沉澱10~15min。
電泳前測序pcr產物的處理
(1) 加入12μl的tsr於離心管中,劇烈振盪,讓其充分溶解dna沉澱,稍離心。
(2) 將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml pcr管中,稍離心。
(3) 在pcr儀上進行熱變性(95℃ 2min),冰中驟冷,待上機。
分析或列印出彩色測序圖譜
上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管,進行毛細管位置的校正,人工手動灌膠和建立運行的測序順序檔案。儀器將自動灌膠至毛細管,1.2kv預電泳5min,按編程次序自動進樣,再預電泳(1.2kv,20min),在7.5kv下電泳2h。電泳結束後儀器會自動清洗,灌膠,進下一樣品,預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h。電泳結束後儀器會自動分析或列印出彩色測序圖譜。
序列分析
儀器將自動進行序列分析,並可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知,可通過序列比較以星號標出差異鹼基處,提高工作效率。
處理儀器
測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。

計算

測序反應精確度計算公式:100%-差異鹼基數(不包括n數)/650×100%
差異鹼基即測定的dna序列與已知標準dna序列比較不同的鹼基,n為儀器不能辨讀的鹼基。

注意事項

1.abi prism 310基因分析儀是高檔精密儀器,需專人操作、管理和維護。
2.本實驗測序pcr反應的總體積是5μl,而且未加礦物油覆蓋,所以pcr管蓋的密封性很重要,除加完試劑後蓋緊pcr管蓋外,最好選用pe公司的pcr管。如pcr結束後pcr液小於4~4.5μl,則此pcr反應可能失敗,不必進行純化和上樣。
3.作為測序用戶來說,只需提供純化好的dna樣品和引物,一個測序pcr反應使用的模板不同,需要的dna量也就不同,pcr測序所需模板的量較少,一般pcr產物需30~90ng,單鏈dna需50~100ng,雙鏈dna需200~500ng,dna的純度一般是a260nm/a280nm為 1.6~2.0,最好用去離子水三蒸水溶解dna,不用te緩衝液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
4.本實驗使用的測序試劑盒是bigdye螢光標記終止底物循環測序試劑盒,一般可測dna長度為650bp左右。本儀器dna測序精確度為 (98.5±0.5) %,儀器不能辨讀的鹼基n<2%,所需測定的長度超過了650bp,則需設計另外的引物。為保證測序更為準確,可設計反向引物對同一模板進行測序,相互印證。對於n鹼基可進行人工核對,有時可以辨讀出來。為提高測序的精確度,根據星號提示位置,可人工分析該處彩色圖譜,對該處鹼基作進一步核對

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