化學降解法

化學降解法

Maxam-Gilbert 化學降解法1977年,A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的測定方法。

基本介紹

  • 中文名:化學降解法
  • 外文名:chemical degradation method
即 Maxam-Gilbert 化學降解法1977年,A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的測定方法,其原理為:將一個DNA片段的5'端磷酸基作放射性標記,再分別採用不同的化學方法修飾和裂解特定鹼基(表6-1),從而產生一系列長度不一而5'端被標記的DNA片段,這些以特定鹼基結尾的片段群通過凝膠電泳分離,再經放射線自顯影,確定各片段末端鹼基,從而得出目的DNA的鹼基序列。Maxam-Gilbert化學降解法測序原理如圖6-1:
表6-1:Maxam-Gilbert化學降解法測序的常用化學試劑:
圖 6-1 化學降解法測序原理圖 6-1 化學降解法測序原理
鹼基體系
化學修飾 試劑
化學反應
斷裂部位
G
A + G
C + T
C
A > C
dimethyl sulphate(硫酸二甲酯)
Piperidine formate(哌啶 甲酸), pH2.0
hydrazine(肼,聯氨NH2.NH2
hydrazine + NaCl(1.5M)
90°C, NaOH(1.2M)
甲基化
脫嘌呤
打開嘧啶環
打開胞嘧啶環
斷裂反應
G
G和A
C和T
C
A和C
酸二甲酯[dimethyl sulphate ,DMS ,(CH3 O)2 SO2 ]是一種鹼性化學試劑,可以使 DNA 鏈上的腺嘌呤 A 的 N2 和鳥嘌呤 G 的 N7 甲基化,但是鳥嘌呤 G 的 N7 甲基化速度比腺嘌呤 A 的 N2 甲基化速度要快 4-10 倍,並且在中性 pH環境中, DMS 主要作用於鳥嘌呤 G ,使之甲基化,導致糖苷鍵斷裂。
哌啶甲酸可以使 DNA 鏈上的嘌呤在酸的作用下發生糖苷水解,導致 DNA 鏈在脫嘌呤位點(G和A)發生斷裂。
肼,又稱聯氨 NH2 .NH2 ,在鹼性環境中作用於胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 的 C4 和 C6 位置,導致糖苷鍵斷裂。如果加入高濃度的鹽(1.2M NaOH),肼則主要作用於胞嘧啶 C ,使之斷裂。
作為標記用的放射性同位素主要有 γ- P([γ- P]ATP,[γ- P]GTP. [γ- P]TTP ,或[γ- P]CTP),或 γ- NTP , S- NTP 。
Maxam-Gilbert 化學降解測序法不需要進行酶催化反應,因此不會產生由於酶催化反應而帶來的誤差;對未經克隆的 DNA 片段可以直接測序;化學降解測序法特別適用於測定含有如 5-甲基腺嘌呤 A 或者 G , C 含量較高的 DNA 片段,以及短鏈的寡核苷酸片段的序列。
化學降解測序法既可以標記 5'-末端,也可以標記 3'-末端。如果從兩端分別測定同一條 DNA 鏈的核苷酸序列,相互參照測定結果,可以得到準確的 DNA 鏈序列。

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