高速逆流色譜儀(High-speed Countercurrent Chromatography，簡稱HSCCC)，於1982年由美國國立衛生院Ito博士研製開發的一種新型的、連續高效的液液分配色譜技術。
基本介紹
- 中文名：高速逆流色譜
- 外文名：High-speed Countercurrent Chromatography
- 研製時間：1982年
- 簡稱：HSCCC
- 研製人：Ito博士（美）
技術簡介,原理,發展史,套用領域,構造,特點,分配係數,溶劑體系,影響因素,技術發展,研究發展,
技術簡介
高速逆流色譜(high speed countercurrentchromatography，簡稱HSCCC)是一種液-液色譜分離技術，它的固定相和流動相都是液體，沒有不可逆吸附，具有樣品無損失、無污染、高效、快速和大製備量分離等優點。由於HSCCC與傳統的分離純化方法相比具有明顯的優點，因此此項技術己被廣泛套用於中藥成分分離、保健食品、生物化學、生物工程、天然產物化學、有機合成、環境分析等領域。我國是繼美國、日本之後最早開展逆流色譜套用的國家。張天佑等在國內首先自行研製了分析型和製備型的高速逆流色譜儀，對我國中藥功能成分的分離製備取得了顯著成果。上海同田生化技術有限公司生產的高速逆流色譜儀，分離中藥成分純度達到99%，可用於HPLC檢測標準樣。
高速逆流色譜
高速逆流色譜高速逆流色譜 （ high-speed countercurrent chromatography ， HSCCC ）是 20 世紀 80 年代發展起來的一種連續高效的液—液分配色譜分離技術， 它不用任何固態的支撐物或載體。 它利用兩相溶劑體系在高速旋轉的螺旋管內建立起一種特殊的單向性流體動力學平衡，當其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續洗脫的過程中能保留大量固定相。
由於不需要固體支撐體，物質的分離依據其在兩相中分配係數的不同而實現，因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，不僅使樣品能夠全部回收，回收的樣品更能反映其本來的特性，特別適合於天然生物活性成分的分離。而且由於被分離物質與液態固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的製備量大大提高，是一種理想的製備分離手段。
它相對於傳統的固—液柱色譜技術，具有適用範圍廣、操作靈活、高效、快速、製備量大、費用低等優點。HSCCC 技術正在發展成為一種備受關注的新型分離純化技術，已經廣泛套用於生物醫藥、天然產物、食品和化妝品等領域， 特別在天然產物行業中已被認為是一種有效的新型分離技 術；適合於中小分子類物質的分離純化。
我國是繼美國、日本之後最早開展逆流色譜套用的國家，俄羅斯、法國、英國、瑞士等國也都開展了此項研究。美國FDA食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)及世界衛生組織（ WHO ）都引用此項技術作為抗生素成分的分離檢定， 90 年代以來，高速逆流色譜被廣泛地套用於天然藥物成分的分離製備和分析檢定中。
原理
1. 逆流色譜是20世紀50年代源於多極萃取技術（非連續性）
但是多極萃取設備龐大複雜、易碎、溶劑體系容易乳化，溶劑耗量大，分離時間長。
多極萃取技術(請點擊查看大圖)
多極萃取技術(請點擊查看大圖)2. 通過公轉、自轉（同步行星式運動）產生的二維力場，保留兩相中的其中一相作為固定相
2.通過高速旋轉提高兩相溶劑的萃取頻率，1000rpm旋轉時可達到17次/s頻率的萃取過程。
高速逆流色譜原理(請點擊查看大圖)
高速逆流色譜原理(請點擊查看大圖)
高速逆流色譜原理2(請點擊查看大圖)3.HSCCC分離流程圖
HSCCC分離流程圖(請點擊查看大圖)發展史
1．20世紀70年代，出現了液滴逆流色譜（DCCC）
特點：
（1）流體靜力學原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES）
（2）分離時間過長、連線處容易出現滲漏等
2．20世紀70年代出現了離心分配色譜儀（Centrifugal partition chromatography，CPC）
特點：
離心分配色譜(請點擊查看大圖)
離心分配色譜(請點擊查看大圖)（1）基於流體靜力學原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES），利用公轉產生的單一力場
（2） 連線處較多而且容易出現滲漏，清洗維護複雜
3．20世紀80年代開始出現了高速逆流色譜，可稱為最先進的逆流色譜
特點：
（1） 基於流體動力學原理（Hydrodynamic equilibrium system，HDES）
流體動力學原理(請點擊查看大圖)套用領域
（ 1 ）天然產物已知有效成分的分離純化
（ 2 ）化學合成物質的分離純化
（ 3 ）中藥一類、五類新藥的開發
（ 4 ）中藥指紋圖譜和質量控制研究
（ 5 ）抗生素的分離純化
（ 6 ）天然產物未知有效成分的分離純化（新化合物開發）
（ 7 ）海洋生物活性成分的分離純化
（ 8 ）放射性同位素分離
（ 9 ）多肽和蛋白質等生物大分子分離以及手性分離等
構造
儀器的中心部分：(a) ITO多層線圈分離柱，它是由100-200米長、內徑為1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有適當內徑的內軸共繞十多層而成，其管內總體積可達300mL左右。(b)平衡器，它可以調節重量，它的作用是讓(a)， (b)相對於中心軸兩邊重量平衡。當在旋轉控制器的控制下，在齒輪傳動裝置作用下，(a)，(b)同時繞中心軸作順時針或反時針的行星運動，即(a)- (b)本身既在自轉，但同時又在繞中心軸公轉，公轉轉速可從0-4000r/min。從線圈分離柱中通過中空的中心軸還同時牽引出了線圈的兩端，一端供泵入液用，一端輸出液體。儀器工作需要互不相溶的兩種液體，一相作固定相， 一相作移動相。儀器工作前，先將作為固定相一相的液體通過恆流泵壓入線圈分離柱，然後用進樣器將待分離的樣品按如圖所示進樣，最後用恆流泵壓入移動相，同時啟動中心部分運轉直到轉速大於600r/min。此時，兩相線上圈分離柱中具有相對運動之勢。由於移動相源源不斷的壓入，阻止了固定相的流出，同時，移動相帶著樣品線上圈分離柱中進行無限次的分配而使複雜樣品得到分離。當移動相經過檢測器時，由於不同的樣品組分會產生不同大小的信號，用記錄儀就能得到逆流色譜圖譜，同時用餾分收集器分步收集移動相就會得到複雜樣品被分開的組分。較大的製備型HSCCC，柱容積可達530m1，一次最多進樣可達20g粗品；較小的分析型的HSCCC柱容積為8m1，進樣量為幾十微克，最大轉速可達4000r/min，分析能力堪與HPLC相媲美。
特點
套用範圍廣，適應性好
由於溶劑系統的組成及配比可以是無限多的，因而從理論上講可以適用於任何極性範圍內樣品的分離，在分離天然化合物方面具有其獨到之處。由於聚四氟乙烯管中的固定相為液體不需要固相載體，因而可以消除固-液色譜中由於使用固相載體而帶來的吸附損失，特別適用於分離極性物質。
操作簡便，容易掌握
儀器操作簡單，對樣品的預處理要求低，一般的粗提物即可進行的製備分離或分析。
回收率高
不需要固相載體，消除了由於樣品在固相載體上的不可逆吸附和降解造成的損失，理論上樣品的回收率可達。在實驗中只要調整好分離條件，一般都有很高的回收率。
重現性好
如果樣品不具有較強的表面活性作用，酸鹼性也不強，即使多次進樣，其分離過程都保持很穩定，而且重現性相當好。
分離效率高，分離量較大
由於其與一般的色譜分離方式不同，能實現梯度洗脫和反相洗脫，亦能進行重複進樣，使其特別適用於製備性分離，產品純度高，製備量大。
分配係數
溶劑系統的選擇是同時選擇色譜分離過程的兩相，是對樣品成功分離的關鍵所在，而樣品中各組分的分配係數決定著這種溶劑系統是否合適，因此分配係數的測定是選擇溶劑系統的重要環節。分配係數的測定多採用薄層色譜法、毛細管電泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。
溶劑體系
高速逆流色譜常用基本溶劑體系表
被分離物質種類 | 基本兩相溶劑體系 | 輔助溶劑 |
非極性或弱極性物質 | 正庚（己）烷-甲醇 | 氯烷烴 |
正庚（己）烷-乙睛 | 氯烷烴 | |
正庚己烷-甲醇（或乙睛）-水 | 氯烷烴 | |
中等極性物質 | 氯仿-水 | 甲醇、正丙醇、異丙醇 |
乙酸乙酯-水 | 正己烷、甲醇、正丁醇 | |
極性物質 | 正丁醇-水 | 甲醇、乙酸 |
上表中是根據被分離物質的極性列出一些基本的可供參考的溶劑體系，它包括非水體系和含水體系。
溶劑系統的選擇對於HSCCC分離十分關鍵。遺憾的是到目前為止溶劑系統的選擇還沒有充分的理論依據，而是根據實際積累的豐富經驗來選擇。通常來說，溶劑系統應該滿足以下要求：溶劑系統不會造成樣品的分解或變性樣品中各組分在溶劑系統中有合適的分配係數，一般認為分配係數在0.2-5的範圍內是較為合適的，並且各組分的分配係數值要有足夠的差異，分離因子最好大於或等於1.5；溶劑系統不會干擾樣品的檢測；為了保證固定相的保留率不低於50%，溶劑系統的分層時間不超過30秒；上下兩相的體積比合適，以免浪費溶劑；儘量採用揮發性溶劑，以方便後續處理儘量避免使用毒性大的溶劑。根據溶劑系統的極性，可以分為弱極性、中等極性和強極性三類。經典的溶劑系統有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在實驗中，應根據實際情況，總結分析並參照相關的專著及文獻，從所需分離的物質的類別出發去尋找相似的分離實例，選擇極性適合的溶劑系統，調節各種溶劑的相對比例，測定目標組分的分配係數，最終選擇合適的溶劑系統。
影響因素
在逆流色譜中，留在管中固定相的量是影響溶質峰分離度的一個重要因素，高保留量將會大大改進峰分離度。
溶劑體系物理因素對保留值的影響（內因）
溶劑體系的物理因素如溶劑的黏度對固定相的保留影響很大，低黏度的溶劑體系可望得到高的固定相保留，界面張力和兩相間的密度差會對溶劑在臨界點附近的分層時間產生較大的影響，一般為保證固定相保留值合適，溶劑體系的分層時小於30s。
2. 轉速的影響
螺旋管的旋轉速度對兩相溶劑在流體動力學平衡時的體積比，也就是對固定相的保留值的影響很大，從而影響了分離效果。當然，並不是轉速越快越好，一般對於分配得不是太好的溶劑體系，如兩相體系帶有氯仿的，還要固定相分層比較慢的兩相體系，通常情況下轉速越高，越易產生乳化現象。
3. 流速的影響
流動相流速也會影響兩相的分布，一般情況下，流動相流速越大，固定相流失加重，但流速過慢會導致分離時間過長，從而造成對溶劑的浪費。
4.溫度的影響
溫度的提高溶劑的黏度有很大的影響，一般提高溫度會獲得高的保留值，而相反降低溫度則得到低的保留值，但一般溫度不可能提高太多，因為所用的都是有機溶劑，沸點很低。
5. 相聯檢測技術
可見光檢測、紫外光檢測技術在HSCCC中套用較多。但有時由於組分對可見光或紫外光無吸收，或是固定相的流失導致流出液乳化，故無法用常用光學檢測器檢測。現己出現了HSCCC與質譜（MS）、電子電離質譜（EI-MS）、化學電離質譜（CI-MS）快速原子轟擊質譜（FAB-MS）、熱噴霧質譜（TSP-MS）和電噴霧質譜（ESI-MS）的聯用。
技術發展
二十世紀六十年代，首先在日本，隨後在美國國家醫學研究院發現了一種有趣的現象：即互不相溶的兩相溶劑在繞成螺旋形的小孔徑管子裡分段割據，並能實現兩溶劑相之間的逆向對流。Ito及其後來者在此基礎上研究並設計製造出了一系列逆流色譜裝置，早期的是封閉型的螺旋管行星式離心分離儀CPC（coil planet centrifuge），用於分離染料，蛋白質和細胞粒子。數年後Ito把流通機制引入到螺旋管柱體系中，使逆流色譜和現代色譜一樣可以實現連續的的洗脫、分離、檢測和收集，並建立了兩個基本的流通體制。其中有在比較簡單的流體靜力學平衡體制HDES基礎上開發的作為分析分離的CCC、用作製備分離的DCCC以及移位腔室CCC等。另一方面，以流體動力學平衡體制HDES為基礎，研製出在重力場作用下的大製備量分離儀器和在離心力場作用下的分析型和半製備型分離儀器。
研究發展
溶劑體系的選擇範圍越來越寬泛，有人提出用超臨界二氧化碳做流動相，利用它的高擴散性、低粘度、流體特性及環境友好等其他溶劑不可比擬的優勢分離化合物，還有人提出用製冷劑做流動相的可能性。還有人提出將三相溶劑體系用於高速逆流色譜分離中，可以對寬極性範圍的樣品進行很好的分離。三相溶劑還只用於標準品混合物的分離，
還沒能用於具體天然產物的分離，相信進行進一步的發展在複雜天然產物以及藥物的分離中有很大套用前景。 pH區帶逆流色譜是一種最新發展起來的製備色譜技術，它能使樣品的負載容量提高10倍以上，即使含量很低的物質也能得到高度濃縮。它是在固定相和流動相中加入一對試劑——保留劑和洗脫劑，保留劑用來把樣品中的各組分保留在管柱內，當含有洗脫劑的流動相以一定流速穿過固定相時，由於酸鹼反應最終達到平衡。以保留劑在兩相中的濃度比標度分配係數保留劑的分配係數，溶質的分配係數與標度值的差異決定了溶質的出峰時間，根據不同組分的Pka和疏水性的不同而實現分離。其色譜峰呈逐一連線的高度濃縮的重疊很少的矩形峰狀，很像替代色譜的色譜峰形。
二元模式逆流色譜法以同一兩相分配溶劑系統洗脫，既可用於正相洗脫也可用於反相洗脫。
HSCCC與質譜等其他技術的聯用也是當前的研究熱點，它把HSCCC分離的多樣性與質譜的高靈敏度檢測和結構分析特性良好地結合在一起，前景十分看好。為了克服HSCCC理論研究相對滯後的不足，有不少研究人員正從事理論研究，試圖建立完善的理論基礎來指導溶劑體系的選擇，以期使HSCCC儘快從一種分離技術發展成為一門分離科學。
