《體外培養殺傷性T細胞的方法》是吉林省拓華生物科技有限公司於2012年12月13日申請的專利，該專利的公布號為CN103013914A，授權公布日為2013年4月3日，發明人是畢薇薇。
《體外培養殺傷性T細胞的方法》經IL-2和抗CD3單克隆抗體聯合大青葉水煎劑協同刺激取自50毫升離體血液的淋巴細胞即可將其誘導為具有細胞毒活性的T細胞，該發明的誘導培養方法獲得的具有細胞毒活性的T細胞增殖數量多，活力好，CD8陽性T細胞數可從20%-30%增加至80%-90%。同時，該發明採集血量少，操作步驟簡單，試劑成本低，細胞成熟時間短，8天即可達到1×10個細胞以上並可供患者靜脈連續輸注6次，每次均達到1×10個細胞以上。該方法適用於臨床上腫瘤患者的生物免疫療法，可廣泛推廣套用。
2016年9月，《體外培養殺傷性T細胞的方法》獲得第二屆吉林省專利獎金獎。
基本介紹
- 中文名：體外培養殺傷性T細胞的方法
- 申請人：吉林省拓華生物科技有限公司
- 申請日：2012年12月13日
- 申請號：2012105409843
- 公布號：CN103013914A
- 公布日：2013年4月3日
- 發明人：畢薇薇
- 地址：吉林省四平市鐵西區南迎賓街89號
- Int.Cl.：C12N5/0783(2010.01)I
- 代理機構：北京戈程智慧財產權代理有限公司
- 代理人：程偉
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
以腫瘤的免疫治療為基礎的腫瘤生物治療作為現代腫瘤治療的第四種模式，越來越受到重視。腫瘤的免疫治療包括主動特異性免疫治療（腫瘤疫苗）和被動免疫治療，其中被動免疫治療包括細胞因子療法（白介素、干擾素、腫瘤壞死因子等）、抗體為基礎的被動免疫治療、過繼性細胞免疫治療（如LAK、TIL、CIK等）以及基因治療。而其中過繼性細胞免疫治療（adoptivecellularimmunotherapy，ACI）是指向腫瘤患者轉輸具有抗腫瘤活性的免疫細胞（特異性的和相對特異性的）直接殺傷腫瘤或激發機體免疫反應殺傷腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。過繼性細胞免疫治療可以單獨用於臨床治療腫瘤患者，更重要的是可以作為手術、放療、化療的補充，與上述三種療法聯合套用，提高療效和改善患者生存質量。因此，ACI近年來一直是腫瘤生物治療中最活躍的研究領域。自1985年Rosenberg報導套用LAK/IL-2治療晚期惡性腫瘤以來，ACI研究進入了高潮，新的免疫效應細胞如腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、抗CD3抗體激活的殺傷細胞（CD3AK）、多種細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）不斷被發現和套用，細胞體外擴增技術和免疫效應細胞殺傷活性的調變方面也有了較大的發展，使得ACI的臨床套用在國內外得以廣泛開展並取得了較好的療效。
相關文獻已有活化的T細胞的培養方法，包括CIK、CTL、LAK細胞培養的報導。但LAK細胞T細胞增殖數量有限，殺傷功能不高。CTL作為特異性細胞毒性T細胞，培養時需用腫瘤組織誘導，使培養受到限制。CIK細胞培養需4種因子聯合刺激，操作步驟較多，試劑成本高。
發明內容
專利目的
《體外培養殺傷性T細胞的方法》的目的是解決上述技術的不足，開發一種提取操作簡單、細胞成熟時間短、細胞殺傷功能強的T細胞的培養方法，為腫瘤免疫治療的廣泛推廣奠定基礎。
技術方案
《體外培養殺傷性T細胞的方法》的第一方面涉及一種培養人細胞毒性T細胞的方法，其包括如下步驟：
a）獲得無菌人全血50-100毫升；
b）用PBS按照1:1比例稀釋上述人全血，在塑膠離心管中預先加入Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液，按分離液：稀釋後血液=1:1～5的比例將稀釋後的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液的上面；
c）室溫下1800轉離心10～30分鐘後棄上清，重懸入40毫升PBS中，混勻；再室溫下1300轉離心8分鐘；棄上清，再重懸入40毫升PBS中，混勻；再室溫下1300轉離心5分鐘；
d）棄上清，細胞沉澱用培養基RPMI-1640懸起，計數淋巴細胞數量；
e）按2×10個細胞/毫升的密度將所分離的細胞懸於RPMI-1640無血清培養液中，懸浮培養於25平方厘米小培養瓶中，每小瓶細胞中加入終濃度500U/毫升的IL-2；
f）第二天或第三天，每瓶培養細胞中加入終濃度50納克/毫升的抗CD3單克隆抗體；
g）第五天或第六天，每瓶培養的細胞按1:3比例傳代於75平方厘米中培養瓶，並加入終濃度為0.4～1.6毫米/毫升的FS；
h）第八天至第十天，細胞數量可增殖到用於臨床治療的水平，
其中FS是指大青葉水煎劑。優選地，無菌人全血的體積為50毫升。優選地，按分離液：稀釋後血液=1:2的比例將稀釋後的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液的上面，室溫下1800轉離心20分鐘分離單個核細胞。優選地，培養當日培養基中加入終濃度500U/毫升的IL-2，次日加入50納克/毫升抗CD3單克隆抗體，第5日加入0.4～1.6毫米/毫升的FS。
更優選地，第5日加入1毫米/毫升的FS。優選地，所述FS的製備方法為：取適量大青葉乾藥材，冷水浸泡20-30分鐘，3次水煎混合液濃縮至約1克/毫升，離心取上清液以CO照射滅菌。優選地，步驟a）的無菌人全血為50毫升。優選地，所述PBS為0.01M、pH7.2的PBS。優選地，所述IL-2為重組人IL-2，所述抗CD3單克隆抗體為鼠抗人CD3單克隆抗體。優選地，培養至第八天至第十天時回收細胞加入1%人血清白蛋白。
換言之，該發明涉及一種高增殖力、高細胞毒活性的T細胞的製備方法，它比以往研究的CIK細胞培養步驟簡單、試劑成本低，但能達到與CIK細胞同等效力的細胞功能。換言之，該發明涉及一種改進的體外獲取殺傷性T細胞的方法，其步驟可簡述如下：
採集外周血50毫升並用PBS1:1稀釋，用淋巴細胞分離液密度梯度離心，提取單個核細胞並用PBS洗滌，用含500U/毫升IL-2的無血清培養基在37℃、5％CO2濃度下培養，次日，在培養液中加入終濃度為50納克/毫升抗CD3單克隆抗體，繼續培養，第5天，T細胞增殖後1:3分瓶並在每瓶培養液中加入終濃度0.8毫米/毫升的FS繼續培養，第8-10天，即得到高增殖力、高細胞毒活性的T細胞。
該發明方法中所用的PBS為常規的細胞培養用PBS，優選濃度為10mM、pH7.2的PBS。該發明方法中所用的淋巴細胞分離液並無特殊要求，優選選用Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液。該發明方法中所用的無血清培養基為常規的細胞培養用無血清培養基，優選選用RPMI-1640無血清培養液。同時，該領域技術人員知曉，雖然該發明所述的方法中對各項參數如稀釋比例、離心速度、離心時間、冷水浸泡時間、次數、濃縮倍數、試劑體積、試劑濃度、細胞密度、器材規格等做了具體的限定，但這些參數均屬於該領域的常規參數，該領域技術人員可以根據具體的實驗對這些參數做出相應的調整而不改變整體的實驗結果。這樣的改變也落入該發明的範圍。對於該發明方法中所列出的上述參數的數據，它們均是實現該發明方法的最佳參數。
改善效果
《體外培養殺傷性T細胞的方法》首次發現，採用基因重組人細胞因子IL-2和抗CD3單克隆抗體聯合大青葉水煎劑可以用來誘導殺傷性T細胞，細胞因子、單克隆抗體與中藥製劑的聯合套用可以對淋巴細胞的擴增產生協同作用，從而使該發明方法僅使用一種細胞因子、一種單克隆抗體和大青葉水煎劑即可達到以往研究的套用4種因子誘導獲得的CIK細胞的細胞增殖數量及活性，而且該研究中細胞毒活性可維持2～3周，細胞最高殺傷率出現在培養的第9～12天。
該發明技術方案獲得的細胞毒活性的T細胞增殖數量多，活力好，CD8陽性T細胞數可從20%-30%增加至80%-90%。該發明的方法採集血量少，減少了患者的痛苦，同時操作步驟簡單，試劑成本低，細胞成熟時間短，8天即可達到1×10個以上可供患者靜脈輸注。該發明的培養方法可給患者連輸6次，每次均達到1×10個以上。
經過形態學觀察及流式細胞術等檢測均符合T細胞增殖特性。該方法適用於臨床上腫瘤患者的生物免疫療法，可廣泛推廣套用。
附圖說明
圖1：顯示T細胞培養第一天的狀態，倒置相差顯微鏡100×，顯示T細胞分散存在。
圖2：顯示T細胞培養第四天的狀態，倒置相差顯微鏡100×，顯示T細胞增殖克隆。
圖3：顯示T細胞剛接種時的CD8為28%。
圖4：顯示T細胞培養第7天時的CD8為88%。
權利要求
1.一種培養人細胞毒性T細胞的方法，其包括如下步驟：
a）獲得無菌人全血50-100毫升；
b）用PBS按照1:1比例稀釋上述人全血，在塑膠離心管中預先加入Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液，按分離液：稀釋後血液=1:1～5的比例將稀釋後的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液的上面；
c）室溫下1800轉離心10～30分鐘後棄上清，重懸入40毫升PBS中，混勻；再室溫下1300轉離心8分鐘；棄上清，再重懸入40毫升PBS中，混勻；再室溫下1300轉離心5分鐘；
d）棄上清，細胞沉澱用培養基RPMI-1640懸起，計數淋巴細胞數量；
e）按2×10個細胞/毫升的密度將所分離的細胞懸於RPMI-1640無血清培養液中，懸浮培養於25平方厘米小培養瓶中，每小瓶細胞中加入終濃度500U/毫升的IL-2；
f）第二天或第三天，每瓶培養細胞中加入終濃度50納克/毫升的抗CD3單克隆抗體；
g）第五天或第六天，每瓶培養的細胞按1:3比例傳代於75平方厘米中培養瓶，並加入終濃度為0.4～1.6毫米/毫升的FS；
h）第八天至第十天，細胞數量可增殖到用於臨床治療的水平，其中FS是指大青葉水煎劑。
2.根據權利要求1所述的培養人細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於無菌人全血的體積為50毫升。
3.根據權利要求1或2所述的培養人細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於，按分離液：稀釋後血液=1:2的比例將稀釋後的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液的上面，室溫下1800轉離心20分鐘分離單個核細胞。
4.根據權利要求1到3任一項所述的培養人細胞毒性T細胞的方 法，其特徵在於培養當日培養基中加入終濃度500U/毫升的IL-2，次日加入50納克/毫升抗CD3單克隆抗體，第5日加入0.4～1.6毫米/毫升的FS。
5.根據權利要求4所述的培養人細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於第5日加入1毫米/毫升的FS。
6.根據權利要求1到5任一項所述的培養人細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於所述FS的製備方法為：取適量大青葉乾藥材，冷水浸泡20-30分鐘，3次水煎混合液濃縮至約1克/毫升，離心取上清液以CO照射滅菌。
7.根據權利要求1到6任一項所述的培養人細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於步驟a）的無菌人全血為50毫升。
8.根據權利要求1到7任一項所述的培養人細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於所述PBS為0.01M、pH7.2的PBS。
9.據權利要求1到8任一項所述的培養人細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於所述IL-2為重組人IL-2，所述抗CD3單克隆抗體為鼠抗人CD3單克隆抗體。
10.根據權利要求1到9任一項所述的培養人細胞毒性T細胞的方法，其特徵在於培養至第八天至第十天時回收細胞加入1%人血清白蛋白。
實施方式
《體外培養殺傷性T細胞的方法》的試驗操作前已通過了該單位的倫理委員會審議並通過。該發明提供一種培養人的活化的細胞毒性T細胞的方法，可用從人的外周血中提取T細胞後刺激增殖。在該發明中，所述方法採用基因重組人細胞因子IL-2和抗CD3單克隆抗體聯合大青葉水煎劑誘導T細胞增殖並增強殺傷功能。
實施例
1、原料：獲取無菌的人全血50毫升，送該院中心實驗室提取並培養。
2、試劑、耗材與儀器
2.1主要試劑與耗材：RPMI1640無血清淋巴細胞培養基（購自天津灝洋生物技術公司，含穩定的谷氨醯胺、不含酚紅，含多種血清替代物），重組人細胞因子IL-2（上海華新生物高技術有限公司），抗CD3單克隆抗體（購自美國Peprotech公司），0.01M、pH7.2的磷酸鹽緩衝液（PBS），大青葉（FS，中藥材大青葉產於河北，藥材公司購買，十字花科），細胞培養瓶，離心管和移液管均購自美國Corning公司。
大青葉水煎劑製備：50克大青葉乾藥材，冷水浸泡20-30分鐘，3次水煎混合液濃縮至1克/毫升，離心2000轉10分鐘，取上清液以CO照射滅菌。
2.2主要儀器：二氧化碳培養箱（美國THERMO公司371型），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司CKX41型），大容量低速離心機（美國THERMO公司Multifuge4KR），流式細胞儀（美國BDFACSCalibur），生物安全櫃（北京東聯哈爾儀器有限公司BSC-1360IIA2）。
3、操作步驟
3.1淋巴細胞的分離提取
3.1.1取離體無菌人外周血50毫升。
3.1.2用磷酸鹽緩衝液（PBS）按照1:1比例稀釋。
3.1.3在50毫升塑膠離心管中預先加入標準Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液，按分離液：稀釋後血液=1:2比例加入稀釋後的血液。
3.1.4小心的將稀釋後的血液加到Ficoll-Hypaque淋巴細胞分離液的上面。
3.1.5室溫下1800轉離心20分鐘。
3.1.6取出離心管，小心吸出白色細胞層，重懸於PBS中，混勻，室溫下1300轉離心8分鐘。
3.1.7吸棄上清，再重懸入40毫升PBS中，混勻，室溫下1300轉離心8分鐘。
3.1.8吸棄上清，再重懸入40毫升PBS中，混勻，室溫下1300轉離心5分鐘。
3.1.9吸棄上清，細胞沉澱用RPMI1640無血清培養液重懸起，計數淋巴細胞數量。
3.1.10按2×10個細胞/毫升的密度將所分離的細胞重懸於RPMI1640無血清培養液中，接種於25平方厘米小培養瓶中，每小瓶細胞中加入終濃度500U/毫升的IL-2。培養的T細胞第一天時的狀態如圖1所示。
3.2增殖培養
3.2.1第二天每瓶培養細胞中加入終濃度50納克/毫升的抗CD3單克隆抗體並繼續培養。培養的T細胞第四天時的狀態如圖1所示。
3.2.2第五天每瓶培養的細胞按1:3比例傳代於75平方厘米中培養瓶中，並加入終濃度0.8毫米/毫升的FS。
3.2.3第六天至第八天，細胞數量可增殖到用於臨床治療的水平，回收細胞加入1%人血清白蛋白備用。
上述獲得的製備物可給患者靜脈輸注。該發明的培養方法可給患者連輸6次，每次均達到1×10個細胞以上。
4細胞及培養方法的驗證
4.1細胞形態學觀察：剛接種的細胞為散在瓶底的圓型有核細胞，培養液中混雜較多紅細胞。培養3天后淋巴細胞增殖較多，呈細胞球狀，紅細胞逐漸死亡。
4.2細胞表面抗原標誌的測定：細胞提取接種當日，取1毫升細胞懸液，計數細胞大於1×10個。用流式細胞儀進行T細胞亞群檢測（檢測指標CD3、CD4、CD8），結果見圖3，結果表明剛接種時的CD8為28%。培養第7天時，抽取細胞懸液再進行T細胞亞群檢測，結果見圖4，結果表明T細胞培養第7天時的CD8為88%。比較CD8陽性細胞毒性T細胞的比率。
4.3培養前後細胞數量的比較：
細胞提取接種當日計數細胞數量為1×10，培養第7天時，抽取細胞懸液計數細胞可達到1×10個以上。
參考文獻：
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4中藥房中藥店工作手冊.廣州：廣東科技出版社，1991:103.
榮譽表彰
2016年9月，《體外培養殺傷性T細胞的方法》獲得第二屆吉林省專利獎金獎。
