顯微標本製作技術是組織學、胚胎學、生理學及細胞學等學科研究觀察細胞、組織的生理、病理形態變化的一種主要方法。大多數的生物材料，在自然狀態下是不適合顯微觀察的，也無法看到其內部結構。在經過固定、脫水、透明、包埋等手續後就可把材料切成較薄的片，再用不同的染色方法就可以顯示不同細胞組織的形態及其中某些化學成份含量的變化，就可以在顯微鏡下清楚地看到其中不同的區域組分狀態，切片也便於保存，所以是教學和科研中常用的方法。
基本介紹
- 中文名：顯微標本製作技術
- 電熱溫箱：溫度調節一般在60-75℃
- 切片刀：為切片機必備配件
- 磨刀機：磨刀用
概述,實驗用品,實驗步驟,
概述
顯微標本製作有許多不同的方法，一般可分為非切片法與切片法兩大類：非切片法有塗片、鋪片、壓片、磨片、整裝片等；切片法又包括石蠟切片法、火棉膠切片法、冰凍切片法等。
顯微標本製作技術雖是生物學中很基本的操作技術，但由於生物材料的個體差異、化學試劑的多樣性，因此操作技術相當細緻而複雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導致整體的失敗，因此需要耐心細緻，不斷總結經驗，才能得到較好的結果。
實驗用品
1、器械
電熱溫箱：體積較小，溫度調節一般在60-75℃
顯微鏡：用於觀察染色情況，及檢查切片效果
切片機：切片用，通常為了能夠得到連續切片，多用轉動切片機
切片刀：為切片機必備配件
磨刀機：磨刀用
電熱溫台：為了展平蠟帶或烤乾製片
天平：配溶液用
玻璃器皿：染色缸、燒杯、量桶、試劑瓶、滴液管等
其它：剪子、鑷子、解剖針、毛筆、刀片、小木塊等
2、常用試劑
2.1 常用固定劑
包音氏固定液：由苦味酸飽和水溶液75毫升、甲醛（40%）25毫升、冰醋酸5毫升配製。該固定液適用於無脊柱動物，其滲透力強，組織收縮小，不易變形。
海利氏液：由重鉻酸鉀2.5克、氯化汞6克、蒸餾水100毫升、40%甲醛液5毫升配製。該液適用於骨髓，脾，肝等適血器官的固定。
卡諾固定液：由純酒精15毫升、冰醋酸5毫升配製。該液滲透迅速，可用作植物組織或細胞的固定，亦適用於動物組織，但不易時間太長，防止組織過度硬化。
約翰森固定液：由福馬林5毫升、丙酸5毫升、50% 酒精90毫升配製。該液用於固定植物根尖、莖尖，有較好的效果，通常固定24小時，也可做保存液。
2.2 常用脫水劑
酒精、正丁醇、叔丁醇、丙酮等。
2.3 常用透明劑
二甲苯、甲苯、氯仿、丁香油等。
2.4 常用貼上劑
明膠貼上劑：明膠1克、蒸餾水100毫升、石炭酸2克、甘油15毫升
蛋白貼上劑：新鮮蛋白25毫升、甘油25毫升、石炭酸0.5克
2.5 包埋劑
石蠟、火棉膠、明膠等
2.6 封固劑
阿拉伯樹膠、加拿大樹膠
2.7 常用染劑
伊紅水溶液：0.1-1% 伊紅又稱曙紅，是酸性染料，一般與蘇木精共同使用，主要染細胞質、膠原纖維及肌纖維。
番紅-固綠對染：固綠染液由0.5%的95%酒精溶液配製，番紅染液由1%的50%酒精溶液。製備植物石蠟切片常用固綠--番紅對染，結果是木質化的細胞壁及細胞核染成紅色，薄而且纖維素的細胞壁和胞質染成綠色。
蘇丹ш染液：蘇丹ш 0.3-0.5克、70%酒精100毫升，此染液主要用於染澱粉粒。
實驗步驟
1 、非切片法
即不用切片機，不經切片手續而製成切片的方法，根據材料性質的不同，有不同的處理方法，該類方法操作簡單快捷，其中鋪片法、封藏法可使原有組織結構不被破壞，塗片法、壓片法彌補了用包埋、切片法所不可能觀察清楚的不足，因此是顯微標本製作的中常用的手段。
1.1 塗片法
主要用於血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片成薄片的液態顆粒性材料，可在載玻片上塗成單層細胞，再經固定，脫水，染色等手段製成永久標本。
1.2 鋪片法
主要用於動、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。 如洋蔥表皮細胞的鋪片製備。
1.3 壓片法
一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，再進行觀察，如植物根尖觀察染色體，花粉粒觀察發育階段等。
1.4 離析法
該方法是利用化學試劑使組織的細胞間質溶解，使細胞能分散成單個個體。經染色、脫水、透明即可觀察其個體形態，適用於肌肉、葉片、莖等部位。
1.5 磨片
用於很堅硬的組織，如骨和牙。
2 、切片法
切片法是必須依靠手或切片機將組織切成薄片來進行觀察的方法。為了能清晰地觀察到動、植物的組織結構及細胞形態，必須先經過一系列步驟將組織內滲入某些支持物質，使組織變硬以利於切成薄片，根據所用支持劑的種類不同，可分為徒手切片法、石蠟切片法、火棉膠切法、冰凍切片法等類型，切成薄片後還需要去蠟，染色、脫水、透明等步驟，將其製成永久標本。
下邊以石蠟切片為例，介紹顯微標本製作方法。
2.1 取材
根據不同的實驗目的，選擇相應的材料，材料要求新鮮、準確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、乾枯。所採集材料應立即放入固定劑，並編號，註明採集時間、地點、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當，即要能說明問題，又要考慮固定劑的穿透能力。一般組織學取材稍大，細胞學取材稍小，植物組織取材稍小，動物組織取材要稍大。
2.1.1動物的麻醉和殺死
從活的動物體上採取材料不象採集植物材料那么容易，因為在不施加麻醉的情況下，有的動物會收縮（如蚯蚓、水蛭），有的會騷動（如蛙、鼠），使我們無法下手。但製片所需的材料又要求越新鮮越好，尤其是細胞學方面的研究對材料的新鮮程度要求更嚴。因此，要割取生活著的動物組織，在一般情況下，就要對動物施行麻醉，然後再割取材料加以固定。但是所用的麻醉藥品，必須以不影響細胞結構為原則。
若是一般的組織學製片，要求不太嚴格的話則可將動物先殺死然後速取其組織進行固定。蛙、蟾蜍、鼠等較小的動物，可用斷頭法殺死，即用普通剪刀剪斷頸部。較大的動物，如天竺鼠、免、貓等可用木槌猛擊頭後部，使其昏倒，或用50毫升的注射器從耳靜脈向心臟注入空氣，使動物發生急性空氣栓塞痙攣而死。
上述動物若需麻醉後取材，則可用脫脂棉球蘸氯仿或乙醚、置於動物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大動物（狗、猴等）套用氨基甲酸乙酯作靜脈注射麻醉。劑量一般為每千克動物體重用1克。麻醉後的動物也需放血後進行取材固定。
昆蟲等小動物可投入充滿氯仿或乙醚蒸氣的大口瓶中，令其麻醉。若要殺死，可將其投入含氰化鉀的毒瓶中。
2.1.2動物組織塊的切割
割取動物組織塊時，需注意以下幾點：
第一，要考慮所取的材料應包括各臟器的重要結構或全部結構，如消化管就應包括黏膜、黏膜下層、肌層和外膜四層結構。若所取的器官太大，不易全部製片時，則可切取能代表該器官的部分材料，如狗的腎臟，可切取包括皮質、髓質和腎盂的一部分為材料。
第二，應注意切割方向。如在管狀器官(腸等)取材時，一般是取其橫切面製片，但要觀察小腸的環行皺壁時，就應取其縱切面製片。
第三，組織塊必須切得小而薄。細胞學製片的組織塊不能超過2毫升，一般組織塊的大小以0.5×0.5×0.2cm為宜，柔軟組織不易切小，可先取稍大的組織塊固定2 - 3小時。等組織稍硬後再切成薄的小塊繼續固定。
2.2固定
動、植物的任何組織部位，要製成切片，首先用化學試劑將其固定，固定的作用在於通過固定劑，在儘量短的時間內使原生質體停止生命活動，並如同生前一樣精細的保存其細胞結構，同時易於後步驟的染色所以良好的固定劑應該具備以下條件：迅速滲入組織殺死原生質體，在短時間內，組織內外完全固定；儘可能避免使組織膨脹或收縮，並且軟硬合適於切片；增加細胞內含物的折光程度，易於鑑別，同時增加媒染作用和染色能力。固定液同時是防腐液，使材料不致變質。
2.3 脫水
脫水是用一種即能與水又能與透明液混合的液體來逐漸置換樣品中游離的水。現採用的脫水劑一般是丙酮或乙醇來進行梯度脫水，脫水的時間，可根據組織的類型，大小而定。
脫水的過程：
一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100% →100%
脫水應逐步而不應跨越太大的進行，否則將引起組織強烈的收縮或變形，在經無水乙醇處理時，應保證試劑的純度。
2.4 透明
透明是用一種即能與酒精又能與包埋介質混合的液體來置換樣品中的酒精，從而為最終的包埋創造一個有利的條件。 現採用的透明劑一般是二甲苯、甲苯、氯仿等。
其過程為：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯
二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強，溶解石蠟量大，又易揮發的優點，其缺點是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時間應根據組織塊大小及質地酌情而定。
2.5 滲蠟
將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，不斷提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換了組織塊中的透明劑，便於今後的包理與切片。 石蠟有液態與固態二種，滲蠟要在恆定溫箱（60°c）中進行，以保證石蠟處於液態中。
2.6 包理
組織塊經石蠟滲透後，其內部間隙已完全被石蠟占據，此時還需要用同種硬度的石蠟包理成蠟塊以利於後邊的切片，包理可用相同的器具，也可摺疊一牛皮紙盒。
將液態石蠟緩緩倒入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒，淺埋在石蠟內，待石蠟冷卻成固態即包埋完畢。
至此，一塊組織已完成前處理過程，可以切片，前邊的步驟表明看來既無高深的理論，又無複雜的技術，一切看似簡單，但一步做不到都會造成整個製片的前功盡棄。
2.7 切片
修塊：切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，並將這組織周圍的石蠟切除，將組織修成一小塊蠟塊並粘在大小適宜的硬木塊上，以便於固定在切片機上。
貼片：一手持毛筆，一手轉動切片機，切片的蠟片連成一長條蠟帶
切下的蠟帶放在一乾淨黑紙上，用小刀根據需要切成數段，分別貼在乾淨載玻片上。在恆溫展片台上展平、烘乾。
2.8 染色
切片可用不同方法，使其乾燥，然後進行染色。因為每一張載片上貼上的是蠟帶，因此必須先用二甲苯去除石蠟再用酒精去除二甲苯，再進入水中，才能染色，染色的方法很多，要根據每張標本要求顯示的目的選擇不同的染劑，最常用的是蘇木精，伊紅染色蘇木精使細胞核是深紫色，伊紅使細胞質顯粉紅色，以此顯示清晰的細胞形態和核的大小，位置，染色後再根據製片的基本原理，使帶水的載片經歷脫水→透明步驟最後喲感樹膠封片
基本步驟如下：二甲苯×2（脫蠟）→酒精+二甲苯（1:1）→100%酒精×2→90% 酒精→80%→70%→50%→30%→水→蘇木精染色(鏡檢)→水→50%→70%→90%→0.5%伊紅(95%酒精配製)→95%→100%×2→二甲苯:酒精(1:1)→二甲苯×2→樹膠封片
簡便方法：
先將各種材料切成片，要薄，不要用力的用鑷子夾，放在載玻片上，在載玻片上滴一滴水，將薄片放入，如顏色十分淡，加碘酒染色，蓋上蓋玻片，用紙巾將水吸乾，即可。
