雙脫氧測序法又名Sanger雙脫氧鏈終止法，是用以確定核酸中核苷酸序列的一個方法。Sanger法是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，並且在每個鹼基後面進行螢光標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見DNA鹼基序列的一種方法。
基本介紹
原理,特點介紹,
原理
利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長几百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。DNA的複製需要：DNA聚合酶，雙鏈DNA模板，帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指導，不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因它在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基，故不能同後續的dNTP形成磷酸二酯鍵。如，存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP（其中一種為α-32P標記）的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5'-引物端和以ddC殘基為3’端結尾的一系列長短不一片段的混合物。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離製得的放射性自顯影區帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準確信息，從而將全部C的位置確定下來。類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時製得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3‘端結尾的三組長短不一的片段。將製得的四組混合物平行地點加在變性聚丙烯醯胺凝膠電泳板上進行電泳，每組製品中的各個組分將按其鏈長的不同得到分離，製得相應的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的鹼基序列。與DNA複製不同的是sanger測序中的引物是單引物或者是單鏈。
特點介紹
終止法測序極為方便，現已完全取代前一代的Sanger加減法，但當初Sanger的巧妙設計仍給人以啟示。由於測序技術的改進現已無需製備單鏈模板，只要有特異引物，可以直接用雙鏈DNA進行測序。
