基本介紹
- 中文名：金黃色葡萄球菌A蛋白
- 外文名：Staphylococal Protein A，SPA
- 發現時間：1940年
- 發現人：Vevwey
成分介紹,觀察分析,觀察方法,結果,理化性質,理化參數,免疫學性質,生物學特性,套用,標準菌種,培養基,性質特點,
成分介紹
金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、簡稱SPA)是細胞壁抗原的主要成分，幾乎90%以上的菌株均含有這種成分，但不同的菌株含量差別十分懸殊。SPA占整個細胞壁蛋白成分的6.7%，通過胞壁肽聚糖以共價鍵與之結合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。
金黃色葡萄球菌A蛋白
金黃色葡萄球菌A蛋白觀察分析
金黃色葡萄球菌A蛋白膠體金（SPA-CG）分子的特徵性構象特點，探討其作為原子力顯微鏡觀測原位標記物的可行性。
觀察方法
套用原子力顯微鏡掃描生理狀態下分布在雲母表面的金黃色葡萄球菌A蛋白膠體金分子，並進行結構分析及理論計算。
結果
極少數平臥的SPA-CG呈中部球形隆起，兩端長短不一的彎曲棒狀肽鏈環抱球形隆起的獨特結構，形成反“C”字形結構，球形隆起直徑為單個膠體金直徑的3～4倍；極少數SPA-CG呈逗號樣；絕大多數SPA-CG呈一側面稍凹的橢球形結構，結構穩定、均一，長徑為（40．88±1．58）nm，寬徑為（20．82±0．68）n，高度（Z軸）為（10．51±0．28）nm。
單個膠體金標記的金黃色葡萄球菌A蛋白分子具有獨特、穩定、均一的特徵性構象，可作為原子力顯微術觀測的原位標記物。
理化性質
SPA是一種蛋白質,由亮、纈、脯、丙、蘇、甘、絲、谷丙、天門冬及賴氨酸等十種胺基酸組成。由於不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以無二硫鍵。紫外光譜和吸收係數為A275nm %=1.65，等電點為pH5.1。SPA十分穩定，用4mol/L尿素、硫氰鹽酸、6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件，以及加熱煮沸均不影響其活性。其分子量因測定方法不同而有所差異。
理化參數
分子量 42 000
金黃色葡萄球菌A蛋白
金黃色葡萄球菌A蛋白沉降係數S 20w(ˊS )
2.10
擴散係數D20W(cm2/s)
4.3×10－7
Stocks半徑(nm)
5.00
摩擦比f/f,min
2.10
粘度(n) (ml/g)
2.90
Hμggins常數
0.66
比容V(ml/g)
0.72
免疫學性質
SPA能與人及多種哺乳動物血清IgG分子中的Fc片段結合，結合的親和性次序依次是豬、狗、兔、人、 猴、鼠、小鼠及牛；對大白鼠、綿羊的親和力差；對馬、犢牛、山羊等無親和力；對所有的魚類、兩棲類、爬行類、鳥類（除少數例外）均不能與之結合。雞的IgG必須與相應的抗原形成複合物才能與SPA結合，原因可能是Ag－Ab複合物改變了IgG的Fc片段的構象。
金黃色葡萄球菌A蛋白
金黃色葡萄球菌A蛋白SPA與IgG結合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。
SPA除與IgG結合外，還能與血清中少量的IgM和IgA結合，SPA菌對各類免疫球蛋白的吸附率：IgG為90%～98%，IgM為2%～30%，IgA為1.5%～20%。
出現共沉反應的SPA與IgG必須有兩個結合部位，它們分別在Fc和Fab段上,缺一雖能與SPA結合，但不出現共沉反應，這種Fab的參與並非SPA－抗體反應。現已研究表明，IgG與SPA的結合部位是CH2和CH3的交界處。
生物學特性
1．免疫原性與過敏原性 SPA做為免疫原能刺激免疫活性細胞合成Ig，又能與其相應抗體的Fab段結合 呈現抗原抗體的特異性反應。SPA－IgG注射家兔皮下可引起Arthus樣反應，還可引起豚鼠的遲發性超敏反應。SPA體外試驗，能刺激豚鼠離體迴腸收縮。
金黃色葡萄球菌A蛋白
金黃色葡萄球菌A蛋白5．去封閉作用 固相SPA能部分去除腫瘤病人和帶瘤動物血清中的封閉活性，從而降低了血清對淋巴細胞介導的細胞毒的封閉作用。
套用
SPA套用很廣，但所有套用的原理都離不開SPA具有與IgG的Fc段的結合能力，主要套用方面如下： 1．SPA菌的協同凝集作用
金黃色葡萄球菌A蛋白
金黃色葡萄球菌A蛋白用已知的標準血清，吸附到SPA菌的表面,使之成為吸附抗體的載體,再以此去診斷相應的未知抗原而產生肉眼可見的凝集顆粒,診斷的抗原可以是顆粒性的,也可以是可溶性的。此種凝集相當於反向間接血凝,但省去間接血凝中的抗體純化,紅血球鞣化等複雜手續,而只需要 SPA菌體及粗製免疫血清即可。所以此法簡單、快速,特異性敏感性均較滿意。目前已用於許多細胞和病毒的檢測及分型。
協同凝集只適用於檢測抗原，未見套用於檢測抗體的報導。
2．作為廣譜第二抗體 用SPA代替抗體IgG的第二抗體，有如下優點：①SPA製備容易，性質穩定，易純化， 對人和多種哺乳動物的IgG都能套用,不受種屬限制。而第二抗體的製備比較麻煩，且需多次免疫動物，在套用上要受同種屬的限制；②SPA的結合力強，相當於游離抗體與抗原的結合力，對人和兔的親和常數均為103 L/克分子，結合後對IgG的活性無影響。無論在0℃、37℃、44℃及56℃幾乎均能立即結合而無需長時間的孵育，因此可以縮短試驗時間，第二抗體在較長的孵育中，出現抗原分解的問題也可以得到解決；③SPA容易標上125 I、螢光素、辣根過氧化物酶、鐵蛋白等，因此可與多種技術相結合；④在檢查細胞上的病毒抗原時，第二抗體往往特異性不強，會非特異性地與細胞膜上的Fc受體結合。SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受體影響，所以有較高的抗IgG特異性；⑤用第二抗體做免疫沉澱試驗時，必須將抗免疫球蛋白的濃度調整至等價，才能產生最佳的沉澱作用。而用SPA菌沉澱，不受此限制，能保證徹底的沉澱；⑥SPA與lgG結合是可逆的，用4mol/L尿素、4mol/L硫氰酸、鹽酸(pH2.5)或鳥嘌呤鹽酸鹽等都可以使之重新解離。
3．用於提取純化IgG 利用SPA與IgG的結合特性提取IgG，比常規採用硫酸銨、Sephadex柱，DEAE柱或免疫梯度離心等法要簡便得多，而且純度好。
4．檢測和提純IgM IgM在病毒的早期診斷中具有重要意義，為了檢測特異性IgM抗體，必須首先在血清中除去IgG。採用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的辦法，利用此法也為IgM的提純開闢了道路。
6、SPA在免疫細胞化學染色中的套用
SPA可為多種示蹤物如螢光素、酶、膠體金、鐵蛋白等所標記，套用較廣的為酶標記SPA和金標記SPA技術，後者將在第七章 中敘述。標記SPA常用的酶為HRP。可套用於間接法。SPA在PAP法中可代替橋抗體。 1.SPA—HRP用於間接法的操作步驟
金黃色葡萄球菌A蛋白(2)用Tris鹽酸緩衝液洗2次，每次3min。
(3)以第一抗體血清覆蓋處理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。
(4)用Tris-HCl緩衝液洗3次，每次5min。
(5)加SPA-HRP處理30min。
(6)Tris-HCl緩衝液洗3次，每次5min。
(7)DAB-H2O2顯色。
(8)復染、脫水、透明、封固。反應物為棕色。
2.SPA用於PAP法的操作步驟
(1)切片脫蠟至水洗。
(4)第一抗體作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。
(5)0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl緩衝鹽液洗片5min。
(6)SPA(1μg/ml)5min。
(7)Tris-HCl鹽液洗5min。
(8)PAP複合物(無種屬限制)，5min。
(9)Tris-HCl鹽液洗切片5min。
(10)DAB(0.6mg/ml)，加0.01%H2O2反應5min，然後水洗。
(11)復染：常用Mayer’s蘇木精液數秒至1min，水洗。
(12)脫水、透明、封固、鏡檢。 3.SPA-HRP的製備 套用Nakane和Kawaoi1974年建立的過碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg，SPA5mg。
(2)加入1ml0.04～0.08mol/L的NaIO4，室溫攪拌30min。
(3)加入1ml0.16mol/L乙二醇，室溫輕攪1h。
(4)對1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸鹽緩衝液充分透析，換緩衝液3次。
(5)加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸鈉緩衝液1ml，室溫輕攪2～3h。
(6)加5mg硼氫化鈉終止氧化，置4℃冰櫃3h或過夜。
(7)對PBS透析24h，4℃離心去沉澱，半飽和硫酸銨洗沉澱結合物3次，溶於1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。
(8)對PBS充分透析，經測定後分裝，貯於-20℃冰櫃中保存備用。
用過碘酸鈉法可以得到很高標記率的HRP-SPA標記物，而且保存了抗體的全部活性，敏感度高，穩定性強，大大優於戊二醛標記抗體法，現在也有HRP-SPA的標記物供應，但要注意由於各家所用的SPA可能來源於不同菌株，在性質上可能存在一些差異。
標準菌種
目前國內使用的大致如下：
1．含A蛋白的葡萄球菌菌株
⑴ No 1800株：系中國科學院微生物研究所保存的由上海市分離出的菌株，其SPA含量、活性及濕菌體收穫量與Cowan 1株相似，且不易出現自凝現象。
⑵ Cowan 1株：為SPA豐富的日本引進標準株，中國科學院微生物研究所編號為ASI 1476
⑶ 799型菌株：從化膿性骨科病人的骨標本中分離出含SPA豐富的菌株。
⑷ 丹麥1972株：由丹麥引進。
2．不含SPA的葡萄球菌株
⑴ Wood 46株：由日本引進，編號為ASI 1477。
⑵ 乙5—株：遵義醫學院保存的SPA菌株。
培養基
常用的培養基配方如下：
1． 配方一
蛋白腖 10.00g
葡萄糖 1.00g
氯化鈉 3.00g
Na2HPO4·12H2O 2.00g
牛肉浸液(或5%牛肉膏) 1 000.0ml
混合，調pH 7.8
2． 配方二
大豆腖 3.00g
氯化鈉 5.00g
葡萄糖 25.00g
Na2HPO4 25.00g
混和，調pH 7.3
3． 配方三
氯化納 5.00g
牛肉膏 10.00g
酵母膏 25.00g
色氨酸 5.00mg
半胱氨酸 100.00mg
瓊脂 40.0g
H2O pH 7.6 1 000.00ml
性質特點
(1)SPA存在於大多數金黃色葡萄球菌中，而不存在於表皮葡萄球菌中。並且主要存在於血漿凝固酶陽性菌株，而不存在於陰性菌株中。前者是致病的，後者是非致病的，但在體內研究中尚未發現SPA和菌株致病性之間有任何肯定的關係。不同菌株間的SPA含量有明顯差異，以I株金黃色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和細胞壁的肽聚糖呈共價結合。抗二甲氧基苯青黴素突變株能產生分泌性SPA，它較之細胞壁所含的SPA在免疫學性質上相似，但易分離，損失少。 (2)SPA為蛋白質成分，僅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而異，用脫氧核糖核酸酶消化細胞壁後超速離心或用加熱油提法，所測分子量為12000～15000。用沉澱平衡分析和在6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽中凝膠過濾，測出分子量為42000。SPA為多肽單鏈，內含3個高度相似的Fc段結合區，每區由50個以上的胺基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是賴氨酸，氨基末端結構尚未肯定。SPA粘度高於球蛋白，等電點為pH5.1，其天然結構十分穩定，在套用6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑的條件下，尚能保存某些三級結構，如將此變性劑除去，則能自然矯正而恢復原有結構。
(3)SPA之所以引起免疫學家的重視，是因為它具有的免疫學特性。SPA具有和人與許多動物如豚鼠、豬、小鼠、猴等IgG結合的能力。SPA結合部位是Fc段而不是Fab段，這種結合不會影響抗體的活性。SPA具有的結合力是雙價的，每個SPA分子可以同時結合兩個IgG分子，也可一方面同IgG相結合，一方面與標記物如螢光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結合。還有一個饒有興趣的事實是，和SPA結合後的IgG可用4mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽等使之解離。SPA對IgG免疫球蛋白亞型的結合有選擇性，如SPA與人IgG亞型：IgG1、IgG2、和IgG4有結合力，唯獨不結合IgG3。只結合IgA2，而不結合IgA1。SPA和禽類血清IgG不結合。
