《酶動力學穩定性機制及其分子設計》是依託上海交通大學，由馮雁擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：酶動力學穩定性機制及其分子設計
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：馮雁
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
酶作為生物催化劑對生物產業具有重大影響，但其較低的生物學穩定性限制了其廣泛套用，因此探求蛋白質穩定化作用機制、建立有效的蛋白質穩定化策略是科學工作者們密切關注的熱點。由於蛋白質結構的複雜性，尚未發現通用的蛋白質穩定化機制。酶活性中心是催化的關鍵部位，而且其較強的柔性使酶極易在整體結構沒有明顯變化的條件下發生微環境變化，從而導致酶失活。本項目針對酶活性中心的易變性，選擇微生物脂肪酶CALB為研究對象，以結構信息為基礎，探討活性中心不同範圍內高B因子殘基對酶穩定性的影響，結合酶動力學和熱力學分析，闡明活性中心區域對酶催化動力學穩定性的影響和作用機制，為能源、醫藥和化工等工業套用提供所需的新酶源。
結題摘要
研究酶穩定性機制，並建立有效的酶穩定化策略，不僅是生物學和蛋白質工程中具有挑戰性的工作，同時也是工業生產中迫切需要解決的問題。大量研究表明，影響酶穩定性的因素很多，但就如何提升酶穩定性尚無統一規律可循。近年來，隨著生物信息學及結構生物學的發展，科學家又提出以選擇分子表面高柔性殘基（具有較大B因子的殘基）進行改造來提高酶穩定性的蛋白質工程策略，但該方法對提升分子量較大，結構較複雜的酶穩定性，尤其是動力學穩定性時存在一定的局限性。發展新的蛋白質工程策略，提高酶生物學穩定性，尤其是動力學穩定性，是擴展酶套用的有效途徑。本研究以CalB為研究對象，通過對穩定因子的系統分析，探索“酶活性中心穩定化”的蛋白質工程策略，在保持酶活性的基礎上提升酶動力學穩定性，以期揭示酶活性中心區域穩定化對酶動力學穩定性的影響，發展有效的酶穩定化新途徑。本研究主要創新性成果有： （1）酶活性中心殘基突變有效提升酶動力學穩定性。我們選取催化Ser105位點10Å以內的胺基酸殘基作為酶活性中心區域，並選擇高B因子殘基作為靶標位點構建疊代飽和突變庫並進行熱穩定性篩選，最優突變體D223G/L278M在48°C下的半衰期為49 min，為野生型的13倍。在顯著提升酶動力學穩定性的同時，對熱解摺疊及化學變性劑解摺疊的抗逆性也同時得到了提升，突變體的熱半解摺疊溫度（Tm）和尿素半解摺疊濃度（Cm）較野生型分別提高了3.6°C和0.5M。大多數突變體在提高穩定性的同時，保持了良好的催化活性。而對蛋白表面區域中的高B因子殘基構建了飽和突變庫，並沒有得到穩定性明顯提高的突變體。 （2）闡明了酶動力學穩定性提高的結構基礎。我們使用X-ray衍射的方法解析了野生型及突變體的晶體結構。通過對比野生型和最優突變體D223G/L278M的晶體結構，發現在D223G/L278M中，一系列的主鏈氧原子和主鏈氮原子發生微小的位置偏移，並在位於活性中心的α10螺旋上形成了一個連續的主鏈間的氫鍵網路，有效的降低了突變體中α10螺旋的相對B因子值，提升了活性中心的剛性。在不同溫度下進行分子動力學模擬，發現在高溫條件下，最優突變體D223G/L278M的α10螺旋的RMSF更低，說明雙點突變在高溫條件下有效地保持了活性中心的剛性。
