《人工設計糖基化調控酶耐熱性的研究》是依託北京理工大學，由馮旭東擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：人工設計糖基化調控酶耐熱性的研究
- 依託單位：北京理工大學
- 項目負責人：馮旭東
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
生物催化轉化中酶的熱穩定性差是限制其實際套用的最重要原因之一，因此，酶分子的耐熱性改造對擴大其工程套用具有重要的理論和實踐意義。前期研究表明，糖基化對蛋白質的結構和耐熱性有重要影響。但目前對於糖基化調控酶耐熱性分子機制的認識尚不明確，大大限制了其在酶分子理性改造中的套用。為此，本項目以課題組前期解析的產紫青黴β-葡萄糖醛酸苷酶的晶體結構為基礎，通過分析其序列特徵及空間構象，確定對酶分子熱穩定性有重要影響的關鍵區域，並基於分子動力學模擬來設計多層次的人工糖基化位點，然後利用畢赤酵母的N-糖基化系統定向引入糖鏈來調控酶的耐熱性，通過系統表征酶學特性及其結構深入研究糖基化對酶耐熱性的調控機理，以創建人工設計糖基化提高酶耐熱性的新方法。以上研究還將為理性改造調控酶的其它抗逆特性提供新思路和新方法，也有利於解決酶在工程套用中的瓶頸問題。
結題摘要
糖基化對蛋白質的結構和穩定性有重要影響，但目前對於糖基化調控酶耐熱性分子機制的認識尚不明確，大大限制了其在酶分子理性改造中的套用。本項目以真菌β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS為對象，研究半理性設計糖基化調控PGUS穩定性的方法。首先，深入的研究了PGUS結構和穩定性的關係。通過和GH2家族的嗜熱糖苷酶的比對，發現了9個潛在的胺基酸位點對PGUS的穩定性有影響，通過定點突變得到了突變體F292L/T293K，其在65 °C下的熱穩定性提高了5倍。以B-factor值為依據，鑑定了loop 205-211為高度柔性區域，通過從嗜熱糖苷酶挖掘穩定性loop將loop 205-211替換後得到的PGUS突變體在70 °C下的熱穩定性提高了11.8倍。通過分子動力學模擬發現PGUS的C-末端具有較高的柔性，通過理性設計的C-末端截除，將β-葡萄糖醛酸苷酶在70 °C下的熱穩定性提高了1.5倍。在此基礎上，研究了在畢赤酵母中異源表達的PGUS（簡稱為PGUS-P）的糖基化對PGUS穩定性影響的分子機制。首先發現PGUS-P有四個位點N28，N238，N383，N594具有糖基化修飾，其中N383和N594的糖基對PGUS-P的熱穩定性有顯著影響。通過分子動力學模擬分別獲得了N383和N594位糖基的構象，揭示了兩個位點的N-糖基功能類似於“連線臂”，能將空間上距離相近的超二級結構域相連，使得其局部結構更加緊湊，從而提高了蛋白質的整體穩定性。以此為啟發，通過對PGUS結構分析，在超二級結構域、結構域、亞基界面間設計了N-糖基化位點，進一步提高了PGUS-P的動力學、熱力學穩定性。酶學性質表征並結合全原子分子動力學模擬結果表明，在結構域界面間的N208位糖鏈和周圍二個結構域產生的作用力，形成了“糖橋”構型，將蛋白質在70°C下的半衰期提高了2.7倍，去摺疊吉布斯自由能提高了8.4 kJ/mol；而在亞基界面間的N40位糖鏈通過和相鄰亞基的作用，形成了“糖卡”構型，將熱穩定性提高了7.1倍，去摺疊吉布斯自由能提高了14.6 kJ/mol。本研究促進了N-糖基化的理性設計，有望使其成為調節蛋白質穩定性的通用技術。
