《魚腥藻脂肪氧合酶熱穩定性提高及其分子機理研究》是呂鳳霞為項目負責人，南京農業大學為依託單位的面上項目。
基本介紹
- 中文名：魚腥藻脂肪氧合酶熱穩定性提高及其分子機理研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：呂鳳霞
- 依託單位：南京農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
脂肪氧合酶(LOX)對小麥麵粉具有強筋和漂白雙重作用，在麵粉品質改良中起重要的作用，是一種潛在的替代溴酸鉀及過氧化苯甲醯的綠色麵粉改良劑。在前期研究中發現重組魚腥藻脂肪氧合酶(Ana-LOX)在麵粉中套用熱穩定性還不夠理想。本項目在已克隆表達Ana-LOX基因的基礎上，旨在通過蛋白質工程技術提高Ana-LOX熱穩定性和活性，並闡明其熱穩定性機理。首先採用定向進化方法對Ana-LOX熱穩定性進行改造，建立Ana-LOX的高通量篩選方法和突變體文庫，以及利用分子動力學模擬和B-factor值分析方法等計算機模擬的理性設計對Ana-LOX熱穩定性改造，獲得熱穩定性與酶活同時提高的突變體；其次，通過結契約源建模和分子動力學模擬以及突變體晶體結構和熱穩定性的關係分析，闡明提高Ana-LOX熱穩定性分子機理，揭示Ana-LOX熱穩定性與酶的結構之間的關係，為酶的熱穩定性分子改良和酶學理論提供理論依據。
結題摘要
脂肪氧合酶(LOX)對小麥麵粉具有強筋和漂白雙重作用，在麵粉品質改良中起重要的作用，是一種潛在的替代溴酸鉀及過氧化苯甲醯的綠色麵粉改良劑。在前期研究中發現重組魚腥藻脂肪氧合酶(Ana-LOX)在麵粉中套用熱穩定性還不夠理想。本研究首先通過重組脂肪氧合酶基因工程菌的破碎條件最佳化，比較了分光光度法、碘化鉀-澱粉法和二甲苯酚橙法測定脂肪氧合酶活力，確定簡單、靈敏、快速且測定體系具備肉眼可辨的特徵顏色碘化鉀-澱粉法用於LOX活性高通量篩選，建立了脂肪氧合酶熱穩定性的高通量篩選體系。其次，利用易錯PCR技術與DNA Shuffling相結合的方法對Ana-LOX進行分子改造，建立隨機突變文庫，通過高通量定向篩選，獲得了熱穩定性與活力提高突變體，並對突變體酶學性質進行研究，分析突變酶熱穩定性提高的原因。同時，對Ana-LOX基因序列進行多序列比對，採用SWISS-MODEL對Ana-LOX進行同源建模，利用B-Fitter軟體分析Ana-LOX三維結構模型PDB檔案，獲得B-值最高胺基酸殘基，通過定點突變獲得突變體文庫，獲得熱穩定性提高突變酶，並通過突變酶結構分析，解析其熱穩定性提高分子機制；並運用“Consensus Concept”技術預測待突變位點，通過建立智慧型型飽和突變庫，結合高通量篩選方法，篩選出熱穩定性提高的突變體，並對其進行突變體組合研究，獲得組合突變體，進一步探究Ana-LOX熱穩定性提高的分子機制。最後，通過分子動力學模擬技術手段分別模擬了Ana-LOX在298K和320K下在水溶液中的運動軌跡，計算均方根偏移與均方根漲落，以RMSF值為熱穩定性評價指標，結合作用力分析預測不穩定區，並通過定點突變，驗證分子動力學模擬的有效性。本研究通過定向進化和理性設計策略對Ana-LOX進行分子改造，獲得熱穩定性與酶活同時提高的脂肪氧合酶突變體，並利用圓二色譜對突變酶的結構進行分析，以及結契約源建模與分子動力學模擬解析，研究發現疏水作用力的引入、氫鍵的形成、靜電相互作用加強等因素，穩定了Ana-LOX結構，從而提高其熱穩定性，闡明了脂肪氧合酶熱穩定性提高的機理，為研究脂肪氧合酶結構和功能的關係提供理論數據和信息。同時，首次套用分子動力學模擬技術預測Ana-LOX的不穩定區域，並驗證了預測的有效性，為脂肪氧合酶分子的熱穩定性改造提供了理論依據。
