載體兩性電解質是一些具有相近等電點的分子量為600－900Da的多氨基多羥基兩性化合物的混合物。它在大於其等電點的pH環境中解離成帶負電荷的陰離子，向電場的正極泳動，在小於其等電點的pH環境中解離成帶正電荷的陽離子，向電場的負極泳動。這種泳動只有在等於其等電點的pH環境中，即蛋白質所帶的淨電荷為零時才能停止。
基本介紹
- 中文名：載體兩性電解質
- 外文名：carrier ampholyte
- 原理：等電點的不同
- 成分：兩性化合物的混合物
- 性質：可溶性好，分子量小，不發螢光等
- 作用：抗污染，製藥等
原理,材料和方法,電泳特點,展望,
原理
載體兩性電解質等電聚焦電泳的基本原理是利用蛋白質分子或其他兩性分子等電點的不同，在一個穩定、連續的線性的pH梯度中進行蛋白質的分離和分析電泳檢測方法。
在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中加入載體兩性電解質(CarrierAmpholytes)，通以直流電後即可形成從陽極到陰極、pH由低到高(即環境由酸變鹼)逐步增加的連續而穩定pH梯度。當蛋白質分子在pH梯度中遷移時，將獲得或失去質子從而攜帶不同數目的電荷。當pH>pI時，蛋白質帶負電荷，在電場的作用下向正極移動；當pH<pI時，蛋白質帶正電荷，在電場的作用下向負極移動；當pH=pI時，蛋白質所帶的淨電荷為零，在電場的作用下不發生移動。隨著其淨電荷和流動性的降低，蛋白質在電場中移動的速度也將放緩。隨著時間的延續，蛋白質會從系統中的任何地方遷移至其穩態即等電點位置，在該位置，蛋白質將不帶電並停止遷移。
如果已經到達等電點位置的蛋白質擴散到pH值較低的區域，那么它仍將會被質子化，並在電場的作用下向陰極遷移。相反，如果它擴散到高於其等電點的pH區域，蛋白質將帶負電荷，並會向陽極驅動。這樣一來，具有不同等電點的蛋白質最終都聚焦在各自的等電點pH處，並形成一個個清晰的區帶。這種“濃縮”或稱“聚焦”效應使等電聚焦的解析度大大高於常規電泳。
材料和方法
兩性電解質的選擇
載體兩性電解質是等電聚焦電泳中最關鍵的試劑，它直接關係到pH梯度的形成以及蛋白區帶的聚焦。載體兩性電解質的常用濃度為2%～2.5%，2%用於2mm厚的凝膠，2.5%用於0.5 mm厚的凝膠，3%用於超薄膠。pH梯度範圍的選擇取決於被分析的蛋白質的等電點。對於未知的樣品通常先用寬的pH範圍來找出欲測蛋白質pI的位置，然後再用合適的窄pH範圍更好地分辨這些譜帶並準確的測定其等電點。使用窄範圍的載體兩性電解質可以提高解析度並增載入樣量。
凝膠的配製和灌膠
介質的選擇 在等電聚焦中大多採用聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠作為穩定介質，它們各有優缺點。聚丙烯醯胺凝膠由於它的高解析度，不僅能分離含有各種生物大分子物質的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，諸如電荷、分子質量、等電點甚至構象等，是實驗室最常用的支持介質。
聚丙烯醯胺溶液的配製 通常丙烯醯胺單體儲備液濃度為30%凝膠單體貯液，T(總濃度)和C(交聯度)分別為30%和3%，臨用前稀釋至所需的濃度。濃度選擇根據所需分離的樣品大小，一般為5%～8%，不能低於3%亦不能高於12%。否則膠濃度過低則凝膠過軟不易操作，且影響解析度；濃度過高則膠的孔徑太小不利於樣品的自由遷移。
制膠 目前常用制膠法有蓋板法、毛細管法和平移法。其中毛細管灌膠法模具簡單，且凝膠厚度、大小可由自己掌握，在實驗室中較常用。平移法採用Ultromould模具灌膠，最為方便，適用於工業生產中的大批量樣品檢測，但凝膠大小和厚度受模具的限制。一般來講，凝膠的厚度越薄，其解析度越高，蛋白條帶越清晰銳利。
電極液的選擇 聚丙烯醯胺等電聚焦電泳的電極液應根據兩性電解質的pH梯度範圍選擇。
等電聚焦電泳及電泳後的檢測
由於pH值具有溫度依賴性以及防止燒膠，一般採用商品化的冷卻系統或將電泳儀和電泳槽置於冷櫃中進行電泳。在等電聚焦電泳中，通常採用恆功率方式。在等電聚焦過程中，隨著樣品的遷移，電流會越來越小，為了使樣品中的組分更好地分離應不斷的加高電壓，高電壓可以減少形成pH梯度和蛋白分離所需的時間。但過高的電壓可能會使樣品變性和影響pH梯度的穩定性，甚至燒膠。等電聚焦的時間取決於凝膠的pH範圍，樣品的遷移率和電泳時的電參數。一般在窄pH範圍所需的電泳時間比寬pH範圍長。這是因為在窄範圍pH環境時蛋白已經接近它的等電點，帶電少，故遷移慢，也就需要更長的聚焦時間。等電聚焦電泳的步驟一般分為預聚焦、點樣、樣品分離和條帶銳化等幾個步驟。
蛋白質在完成等電聚焦電泳後經固定、染色以及脫色等步驟後即可檢測其等電點，常用的有等電點標準掃描定位法和pH梯度曲線作圖法。其原理均是根據蛋白在pH梯度遷移率的不同而計算得來，可根據各自實驗室的情況進行選擇。
電泳特點
載體兩性電解質等電聚焦電泳具有很多優點，如解析度高、能抵消擴散作用而使區帶越走越窄、聚焦濃縮稀樣品、重複性好、精確度高等。但其也存在不足之處，如對樣品的純度要求較高；要求樣品成分在等電點時穩定，不適宜用於在等電點時不溶解或變性的蛋白質。
展望
因為調節蛋白質的等電點(pI)簡便易行，具有實用價值，是許多科研工作者首選的方法之一。蛋白質等電點掌握準確的程度，直接關係到最終生產藥物的質量和科研工作的成敗。所以，測定出真實、準確的蛋白質等電點(pI)是科研工作達到預期的目的和生產工藝付諸實施的重要前提，是保證產品質量、完善生產工藝的重要因素。
自等電聚焦電泳技術開始套用於蛋白的理化性質研究以來，尚無其他技術可以完全取代。目前，已有商業化的IEF凝膠出售，部分IEF過程如灌制、染色等已經程式化。但人們渴望得到的等電聚焦電泳應該是解析度能不斷提高，能夠分離極端酸性、極端鹼性、難溶、大分子量蛋白，操作過程趨於簡化，最好能全面的自動化，對蛋白質的定量定性分析更靈敏、快速、準確、經濟實用。相信在不遠的將來等電聚焦電泳技術會日臻完善並滿足上述要求，在蛋白質理化性質研究尤其是重組蛋白藥物的工藝建立以及質量研究等方面發揮更大的作用。
