二維凝膠電泳

二維凝膠電泳(two—dimensional gel electrophoresis，2一DE)是目前蛋白質組研究中最有效的分離技術。它由兩向電泳組成，第一向是以蛋白質電荷差異為基礎進行分離的等電聚焦凝膠電泳，第二向是以蛋白質分子量差異為基礎的SDS-聚丙烯醯氨凝膠電泳。

基本介紹

• 中文名：二維凝膠電泳
• 外文名：two—dimensional gel electrophoresis
• 套用：蛋白質組研究
• 目的：蛋白質分離
• 基礎：蛋白質不同的等電點和分子量
• 維度：二維平面

簡介

二維凝膠電泳(two—dimensional gel electrophoresis，2一DE)是目前蛋白質組研究中最有效的分離技術。它由兩向電泳組成，第一向是以蛋白質電荷差異為基礎進行分離的等電聚焦凝膠電泳，第二向是以蛋白質分子量差異為基礎的SDS—聚丙烯醯胺凝膠電泳。

雙向凝膠電泳技術最先是由O’Farrell於1975年所描述，其原理是在相互垂直的兩個方向上，分別基於蛋白質不同的等電點和分子量，運用等電聚焦電泳和SDS一聚丙烯醯胺凝膠電泳把複雜的蛋白質成分分離和展現在二維平面上。

1、等電聚焦凝膠電泳

是依據蛋白質分子的淨電荷或等電點進行分離的技術。在等電聚焦過程中．電場所採用的載體兩性電解質含有脂肪族多氨基多羧酸，可在電場中形成正極為酸性，負極為鹼性的連續pH梯度。蛋白質分子在一個載體兩性電解質形成的連續而穩定的線性pH梯度中電泳，當蛋白質遷移到其等電點位置時．淨電荷為零．在電場中不再移動．因此可將各種不同等電點性質的蛋白質分離開來。

2、SDS一聚丙烯醯胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子去污劑，它能與蛋白質的疏水部分結合，從而使蛋白質獲得負電荷，這種大量的負電荷基本上禁止了沒有SDS時正常存在的任何一種電荷，使得在SDS-PAGE時，電泳遷移率僅與分子大小相關，由此使不同分子量的蛋白質得以分離。

二維凝膠電泳技術的原理

蛋白質的分離

目前所套用的二維凝膠電泳體系其原理是根據蛋白質的兩個一級屬性，即等電點和相對分子質量的特異性，將蛋白質混合物在電荷(採用等電聚焦方式)和相對分子質量(採用SDS—PAGE方式)兩個方向上進行分離。蛋白質混合物在第一維方向上的分離是利用蛋白質等電點的不同在大孔凝膠中將蛋白質分離開，這一過程被稱作等電聚焦。蛋白質是兩性分子，根據環境pH的不同分別帶正電、負電或零電荷，在pH高於其等電點的位置時，蛋白質帶負電，反之帶正電。在電場作用下，蛋白質分子會分別向正極或負極漂移，當達到與其等電點相同的pH位置時，蛋白質不帶電，就不再發生漂移。根據此原理，開始的等電聚焦在凝膠中預先由小分子載體兩性電解質形成pH梯度。載體兩性電解質是一些可溶性的兩性小分子，它們在其pI附近有很高的緩衝能力。當電壓加在載體兩性電解質混合物之間時，最高pI值的分子(帶正電荷最多的分子)移向陰極，最低pI值的分子(帶負電荷最多的分子)移向陽極，其餘分子將根據其pI值在兩個極值之間分散，形成一個連續的pH梯度；當蛋白質遷移至與其等電點相同的pH位置時，帶電狀態達到平衡，不再遷移，結果等電點不同的蛋白質分子得到分離。蛋白質帶電狀態取決於其二級結構，因此，沒有完全去除二級結構的蛋白質，就可能會產生連續分布的帶電狀態各異的同一蛋白質的各種構象，從而在2一DE膠上產生條紋現象而降低解析度。因此，要達到最好的解析度，蛋白質必須充分變性，如在9moL/L尿素和70moL/L二硫蘇糖醇條件下變性。

蛋白質混合物在第二維方向上的分離是按照蛋白質的相對分子質量的大小進行分離。蛋白質是帶電的生物大分子，在第二維方向按其相對分子質量分離時，為了消除電荷的干擾，需要採用十二烷基硫酸鈉(SDS)對蛋白質進行變性處理。在2一DE譜上所看到的是不完整的蛋白質亞基分子，而SDS是一種強離子去污劑，作為變性劑與助溶性試劑，可以斷裂分子內與分子間的氫鍵或其他非共價鍵，使分子變性，破壞蛋白質分子的=級結構與三級結構；同時，強還原試劑巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑後，蛋白質分子被解聚成它的多肽鏈。解聚後的胺基酸側鏈與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質SDS膠束，所帶的電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷，這就消除了不同分子之間原有的電荷差異。因此這種膠束在SDS—PAGE中的電泳遷移率不受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決於蛋白質或亞基的大小。

分離膠的染色

二維凝膠電泳分離後的蛋白質點經顯色後才能被鑑定。二維凝膠電泳中的顯色是一個重要的步驟，常用的非放射性染色方法中最靈敏的為銀染法，其靈敏度可達到1 ng甚至更低；其次是螢光染色以及銅染、鋅一咪唑負性染色、考馬斯亮藍染色等，後者染色靈敏度為50～100ng。由於銀染凝膠的質譜鑑定較難，附著在凝膠基質上的肽片段膠內提取效率較低，因此，大多實驗室用銀染尋找差異蛋白質點，再加大上樣量，進行考馬斯亮藍染色，結合膠內酶切提取鑑定蛋白質。

分離膠的圖像分析

圖像分析也是2一DE研究的重要方面。獲得蛋白質二維凝膠電泳圖像後，要對凝膠圖像進行備份保存，以數位化圖像的形式將其存儲下來，而且要儘量完整地保留其定性和定量信息，以利於進一步的分析。通過對批量二維凝膠圖譜的分析，應該獲得的信息包括每一塊凝膠中分離得到的總蛋白質點數、凝膠之間的批次重珊陛、蛋白質點的缺失和出現以及多塊膠之間蛋白質點的表達豐度的定量變化。這些工作僅僅依靠眼睛的分辨能力來完成是不現實的。要對上千個蛋白質點進行分析，只有依賴於凝膠圖像分析軟體。目前已有數種商業化的圖像處理軟體包，可以方便地處理二維凝膠電泳圖譜。

現在進行二維凝膠電泳結果圖像分析時，均採用計算機軟體比對。為了準確地比較分析，必須採用校正標準化的方法：①強度校正，在掃描前，使用灰度尺解決圖像掃描設備的非線性應答問題，同時可把圖像中的像素值轉換為實際的光密度。②匹配時，可建立平均凝膠，即通過把一組凝膠經統計學處理合併在一起生成的模擬凝膠。創建平均凝膠可在同一樣品的一組凝膠中生成一張有代表性的凝膠。當比較兩個不同的樣品時，用平均凝膠可以獲得更多的信息，且更具有穩定性，通過計算機處理得到一個可信的結果。在現在的圖像分析過程中，雖然有計算機取點、匹配，但仍然需要進行人工校對。因為計算機會將背景誤認為是蛋白質點，或漏掉膠上顏色較淡的點，也會將多個蛋白質點看成一個點，這些都必須經過手工凋整，耗時耗力，且增加人為誤差。所以，二維分析軟體的靈敏度、精確度、解析度、自動化都有待於進一步提高。

特別值得一提的是二維電泳凝膠上的點與蛋白質並不具有一一對應關係。這是由於：①同一基因有不同的表達產物；②同一蛋自質因不同的結構修飾而產生不同的斑點；③同一蛋白質因降解而成多個蛋白質碎片斑點。

二維凝膠電泳的步驟

二維凝膠電泳技術主要包括四步：①樣品的製備；②等電聚焦；③SDS—PAGE；④染色和分析結果。

樣品的製備

樣品製備是二維凝膠電泳中最關鍵的一步，它將直接影響二維電泳的結果。由於樣品來源千差萬別，對於每一個樣品來講，最好的提取蛋白的方法要通過多次實驗來摸索。理想狀態應使樣品中的蛋白能完全溶解、解聚、變性、還原。

目前，為了提高蛋白的溶解性，多採用蛋白質分步提取方法。即以三種分別適合溶解高、中、低親水性蛋白質的裂解液分步提取細胞中的蛋白質組分：第一步，水溶液提取；第二步，含Urea—CHAPS—DTF的溶液提取；第三步，含硫脲一SB3—10一TBP的溶液提取。分步提取法可提高疏水蛋白的提取率和蛋白質的解析度，而且對待鑑別的蛋白質斑點能提供更多的信息。還有對樣品進行預分級分離，可更有效地利用樣品，檢出更多的蛋白質組分，但有分離不完全、分離產量低及蛋白質之間的交叉污染等缺點。

第一向等電聚焦

等電聚焦(IEF)是在一條寬3mm的IPG乾膠條上進行，樣品溶解在泡漲液中，一起加在膠條上。固相pH梯度膠條(IPG)由Bjellqvist在1982年報導，在這之前，經典的2一DE第一向是用管狀膠在載體兩性電解質溶液造成的pH梯度中進行。由於CA所形成的pH梯度不連續，所以在電泳過程中容易產生PH梯度漂移，再加上蛋白上樣量偏低，使得2一DE的結果重複性不佳，不能在一塊膠上分析大量蛋白質，限制了2一DE的套用。IPG乾膠條的出現是二維凝膠電泳重新興起的重要原因。它是將兩性分子在膠聚合時就形成pH梯度固定在凝膠條上，膠條背面有塑膠支撐膜。IPG乾膠條的優點有：①pH梯度穩定，聚焦準確，精確度高，梯度解析度可達0.001pH。②可根據實驗需要選擇不同的pH範圍，分離更多的酸性和鹼性蛋白。Wildgruber報導，採用窄pH膠條(pH3.5～6.7，lpH單位)，可將觀察到的酵母蛋白點總數從755個增加到2286個。③無陰極漂移、鹼性蛋白丟失的現象。④塑膠支撐膜防止凝膠條伸長或破裂，使實驗更容易操作。⑤蛋白上樣量更高，可達1～2mg，是兩性電解質等電聚焦上樣量的10倍。⑥樣品中鹽的干擾少，無邊緣效應。⑦實驗具有可重複性。

在等電聚焦過程中，電壓逐漸上升，低電壓使蛋白能更好地轉移至膠條中，高電壓使蛋白在電場中運動至它的等電點位置。一般等電聚焦需16～2dh，因為蛋白質在接近它等電點位置時遷移相當緩慢。等電聚焦結束後，IPG膠條需經平衡後才能進入第二向SDS—PAGE。

第二向SDS—PAGE

SDS—PAGE是根據蛋白質的相對分子質量來分離蛋白。SDS(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯醯胺)是一種陰離子去污劑，包圍在蛋白質周圍，形成過量的負電荷，去除電荷的影響；SDS也能破壞氫鍵、蛋白質間的疏水鍵，使蛋白部分去摺疊，減少蛋白質第二、第三結構對相對分子質量的影響，而只能根據蛋白質的相對分子質量分離蛋白。

目前，可根據實驗的不同選擇大小不同的膠，並最多能進行12塊膠同時電泳，減小了實驗誤差。

染色和圖像比對

凝膠染色多採用硝酸銀染色、考馬斯亮藍染色、放射性螢光染色。放射性螢光染色靈敏度最高，可檢測到10^-6mg/L濃度級的蛋白。硝酸銀染色靈敏度也較高，可達4ng，但進行質譜分析時不易去除銀離子。考馬斯亮藍染色靈敏度不如硝酸銀染色，但操作簡便，可進行定量分析，做質譜時多用該法。現在實驗室一般的方法是：進行多次二維凝膠電泳，硝酸銀染色後尋找蛋白差異點，再行考馬斯亮藍染色，找出相對應的蛋白差異點，做質譜分析。還有的方法是先把膠上的蛋白印跡到PVDF膜上後再進行分析，確定它們是已知蛋白還是未知蛋白。

方法評價與套用

雙向凝膠電泳技術主要用於分離細胞或組織蛋白質提取物，構建特定細胞或組織蛋白質的二維電泳圖譜，分析特定條件下蛋白質的表達狀況，進行差異電荷分離過程即等電聚集與質量分離過程結合到一起，以期獲得細胞內的全部基因產物。其完整步驟應包括樣品製備、等電聚焦、平衡轉移、SDS一聚丙烯醯胺凝膠電泳、斑點染色、圖像捕獲和圖譜分析等。