螢光測定法

將硫胺素氧化為硫色素並測定其螢光值以此計算提取物中硫胺素的含量。螢光強度與硫胺素的含量成正比。

基本介紹

• 中文名：螢光測定法
• 儀器：螢光計，色譜管
• 試劑：色譜樹脂，2N醋酸鈉溶液等
• 原理：螢光強度與硫胺素的含量成正比

簡介

將硫胺素氧化為硫色素並測定其螢光值以此計算提取物中硫胺素的含量。螢光強度與硫胺素的含量成正比。

配備有窄透光度範圍的濾光片，其輸入濾光片最大波長約為365nm，輸出濾光片的最大波長約為435nm。

玻璃色譜管〔全長275mm，容量約60ml〕。由下述三部分熔接而成，大致尺寸〔內徑〕如下：

頂部：盛液器長95mm直徑30mm，收縮至中間部分。

中間部分：吸附管長145mm直徑6mm。收縮至下部。

下部：管子拉伸為毛細管，長35mm，直徑為當管子充滿時其流速<1ml/min。

所用原料

色譜樹脂

加300ml 2N HCl至50g Bio-Rex70〔H型〕中。攪拌15min，傾出並重複操作。加300ml H2O，攪拌1min，傾出並重複至H2O的pH4.5－7.0。使沉降15s，H2O中應無懸浮樹脂。如並非如此，重複H2O洗至澄清。

2N醋酸鈉溶液

溶解272gNaOAc·3H2O於足夠量的H2O中使成1L。

溴甲酚綠指示劑

將0.1g指示劑在瑪瑙研缽中與2.8ml 0.05N NaOH研磨溶解，用H2O稀釋至200ml。

酶溶液10%(w/v)

溶解10g高氏澱粉酶於H2O中，並稀釋至100ml。每天新鮮配製。

氯化鉀溶液

25%(w/v)，溶解250g KCl於足夠量的H2O中使其成1L。

酸式氯化鉀溶液

加8.5ml HCl至1L中性KCl溶液中。

鐵氰化鉀溶液

1%，溶解1g K3Fe(CN)6於足夠量H2O中，並稀釋至100ml。每天新鮮製備。

氧化劑

將4.0ml 1%K3Fe(CN)6溶液與足量的15%NaOH溶液混合使其成100ml。製備後4h內使用該試劑。

異丁醇

在全玻璃儀器中蒸餾。

硫酸奎寧貯備液

用硫酸奎寧液檢查螢光計的再現性。將10mg硫酸奎寧溶解在足量的0.1N H2SO4中使成1L。貯備液貯存於紅色或琥珀色瓶中。

硫酸奎寧標準液

用足量的0.1N H2SO4稀釋5.0ml硫酸奎寧貯備液使成200ml。該液的螢光強度約與從1μg硫胺素得到的硫色素的異丁醇提取液的螢光強度相同。該液貯存於紅色或琥珀色瓶中。

酸化乙醇

20%(w/v)。將250ml乙醇用H2O稀釋使成1L。滴加HCl調節pH至3.5－4.3。

m 醋酸

3%，用H2O稀釋30ml冰醋酸至1L。

色譜管制備

按下述方法製備色譜管：藉助玻璃棒將細的玻璃棉塞置於毛細管的上端。仔細地將盛液器壁上的樹脂洗下來，加水懸浮1.0－2.0g樹脂至吸附管中，吸附過程中保持樹脂表面上的液層，以使吸附管與空氣隔絕。將充滿水〔防止夾雜空氣〕的橡皮帽置於毛細管的底端以防色譜管流乾。

鹽酸硫胺素標準液製備

標準貯備液

100μg/ml。精確稱取50mg USP鹽酸硫胺素參比標準〔預先貯存於P2O5乾燥器中乾燥〕品，由於參比標準易吸濕，在稱量過程中應採取措施避免吸收水分。將50.0mg標準移至500ml容量瓶中，溶於酸化的20%乙醇中，再用酸化乙醇稀釋至500.0ml。置於紅色或琥珀色玻塞瓶中於冰櫃中保存。溶液可穩定數月。

標準工作液

3μg/ml。將3.0ml標準貯備液用0.1N HCl稀釋使成100ml。每天新鮮製備。

樣品製備

將固體物充分分散在液體中，如產生結塊，猛烈振搖以使所有顆粒與液體接觸，在95－100℃蒸汽浴或沸水浴中，在頻繁混合下消化30min，或在121℃高壓加熱混合物30min。$$冷卻，如產生結塊，攪拌混合物直至顆粒充分分散。

將固體物充分分散在液體中，如產生結塊，猛烈振搖以使所有顆粒與液體接觸，在95－100℃蒸汽浴或沸水浴中，在頻繁混合下消化30min，或在121℃高壓加熱混合物30min。$$冷卻，如產生結塊，攪拌混合物直至顆粒充分分散。

將固體物充分分散在液體中，如產生結塊，猛烈振搖以使所有顆粒與液體接觸，在95－100℃蒸汽浴或沸水浴中，在頻繁混合下消化30min，或在121℃高壓加熱混合物30min。$$冷卻，如產生結塊，攪拌混合物直至顆粒充分分散。

酶水解

分別將冷的樣品和標準提取液定量轉移至100ml容量瓶中，用約5ml 2N NaOAc溶液調節各溶液和pH至4.0－4.5。〔用溴甲酚綠指示劑在試板上檢查〕。加5ml酶溶液，混勻，在45－50℃培養3h，冷卻，用0.1N HCl稀釋至100ml，用已知不吸附硫胺素的濾紙過濾〔無灰濾紙是適宜的〕。

淨化

分別將10ml過濾過的標準和樣品溶液〔約含1.5μg鹽酸硫胺素〕通過製備的色譜柱。用每份5ml近沸的H2O洗滌每根管3次。注意：要避免液面降至樹脂表面以下。$$將5份4.0－4.5ml近沸的酸性KCl溶液通過每根柱子，從樹脂上洗脫硫胺素。在加入最後1份酸性KCl溶液前，注意，要避免液面降至樹脂表面以下。將標準水解和淨化後獲得的洗脫液收集在25ml容量瓶中，冷卻並用酸性KCl溶液稀釋定容。指定該液為標準液。將樣品水解和淨化後獲得的洗脫液收集在25ml容量瓶中，冷卻並用酸性KCl溶液稀釋定容。指定該液為測定液。

氧化硫胺素為硫色素

結果的精密度和準確度取決於下述氧化步驟處理中技術的一致：$$分別向4個或4個以上40ml試管或反應容器中，加入1.5g NaCl或KCl以及5ml標準溶液〔硫色素是光敏物質，該溶液應避光〕。$$用在1－2s內能放出3ml的移液管，將已吸取氧化劑的移液管的尖頭置於試管管頸處，握住它使氧化劑液流不碰擊管壁。緩慢搖動試管使液體產生旋轉運動並立即加入3ml氧化劑。移去移液管，再搖動試管確保混勻，放置9.0ml，立即加入13ml重蒸餾的異丁醇。塞上管塞，猛烈振搖15s。同樣處理1個或1個以上另外的試管。除了以3ml 15% NaOH代替氧化劑外，以同樣的方法分別處理2個或2個以上剩餘的試管〔標準空白〕。$$分別於4個或4個以上相似的試管中，加入5ml測定液，按照含標準液試管〔包括加1.5gNaCl或KCl〕的所說的同樣方法處理這些管子。$$各管加入異丁醇後再振搖約2min，低速離心直至得到澄清的上層液，分別從各管吸取或傾析出約10ml異丁醇提取液〔上層〕至比色池，測定硫色素的螢光值。

硫色素螢光值的測定

測定從氧化測試液來的異丁醇提取液的螢光值，稱該讀數為“U”。測定用3ml 15% NaOH溶液處理過的測試提取液〔測定空白〕的螢光值，稱該讀數為“b”，測定用3ml 15% NaOH溶液處理過的標準液提取液的螢光值〔標準空白〕，稱該讀數為“d”。$$鹽酸硫胺素mg/L餵飼食品=[〔U－b〕/〔S－d〕]$$×[15/(A×1000)]×R$$式中U=測試樣品的讀數；b=測試樣品空白的讀數；S=標準樣品的讀數；d=標準樣品空白的讀數；R=使成1L餵飼食品配方所需樣樣的重新組成值，以重量或容量表示；A=樣品量，以g或ml表示。

注釋和注意點

硫色素在異丁醇溶液中是穩定的，但需要立即讀數，通常在20min內不改變結果〔只要溶液不暴露在強日光下〕。$$兩份平行樣品通過測定步驟，得到的值應在平均值的±2.5%以內。在不同日期測定同類樣品應在平均值的±5%以內。$$在讀取樣品硫色素螢光值中間，用奎寧工作液校對螢光光度計。