螢光定量PCR

螢光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR)， 是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過螢光染料或螢光標記的特異性探針，標記跟蹤PCR產物進行實時監測反應，利用與之相適應的軟體對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

基本介紹

• 中文名：螢光定量PCR
• 外文名：real-time PCR
• 目的：計算待測樣品模板的初始濃度
• 分類：絕對定量和相對定量

原理

螢光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入螢光基團，通過螢光信號不斷累積而實現實時監測PCR全程，然後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時螢光定量PCR中，對全程PCR擴增過程進行實時檢測，根據反應時間和螢光信號的變化可以繪製成一條曲線。

2個概念

①螢光域值(threshold)的設定：PCR反應的前15個循環的螢光信號作為螢光本底信號，螢光域值的預設設定是3～15個循環的螢光信號標準偏差的10倍。

②Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是每個反應管內的螢光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。

3個階段

①螢光背景信號階段：在螢光背景信號階段，擴增的螢光信號與背景無法區分，無法判斷產物量的變化。

②螢光信號指數擴增階段：只有在螢光產生進入指數期， PCR產物量的對數值與起始模板量之間存線上性關係，所以在PCR反應處於指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，由此來推斷模板最初的含量而進行定量分析。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存線上性關係，起始拷貝數越多，Ct值越小。通過已知起始拷貝數的標準品可得到標準曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

③平台期：在平台期，擴增產物已不再呈指數級的增加，所以反應終產物量與起始模板量之間已經不存線上性關係，通過反應終產物也算不出起始DNA拷貝數。

分類

螢光化學分類

實時螢光定量常用的螢光化學分類有SYBR Green I法和Tag Man探針法。

①SYBR Green I法：SYBR Green I是一種具有綠色激發波長的染料，最大吸收波長約為 497 nm，發射波長最大約為 520 nm，可以和所有的 dsDNA 雙螺旋小溝區域結合。因為在游離狀態下 SYBR Green I 發出的螢光較弱，但是當它與雙鏈 DNA 結合後，螢光就會大大增強，而且螢光信號的增加與 PCR 產物的增加完全同步。此法的優點是它可以監測任何 dsDNA 序列的擴增，檢測方法較為簡單，成本較低，但也正是由於螢光染料能和任何dsDNA 結合，如非特異性擴增產物和引物二聚體也能與染料結合而產生螢光信號，使實驗產生假陽性結果，因此其特異性不如探針法。因為非特異性產物和引物二聚體的變性溫度要比目標產物的低，所以可以在熔解曲線反應過程中利用軟體分析儀器收集到信號進行鑑別。

②TaqMan探針法：TaqMan 探針法是具有高度特異性的定量 PCR 技術。它的工作原理是在 PCR 反應體系中存在一對 PCR 引物和一條探針，探針的5′ 端標記有報告基團，3′ 端標記有螢光淬滅基團，探針只與模板特異結合，其結合位點在兩條引物之間。當探針完整的時候，報告基團的螢光能量被淬滅基團吸收，所以儀器蒐集不到信號，隨著反應的進展，Taq酶遇到探針，利用 3′→5′ 外切核酸酶的活性把探針切斷，導致報告基團的螢光能量不能被淬滅基團吸收，產生了螢光信號，因此信號的強度就代表了模板 DNA 的拷貝數。

定量方法分類

在實時螢光PCR中。模板的定量有2種方法：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過已知的標準曲線來確定我們所感興趣基因的拷貝數；相對定量指在一定樣品中靶序列相對於另一參照序列的量的變化。

①絕對定量：用已知的標準曲線對未知樣本的量進行推算的方法為絕對定量法。此種方法需要明確標準樣品的濃度情況，然後稀釋標準樣品，分為幾個不同梯度濃度然後進行反應測試。橫坐標為標準品拷貝數的對數值，縱坐標為測得的Ct值，進而繪製出標準曲線。以標準曲線為基礎，在定量分析未知樣品過程中根據其ct值能夠將樣起始拷貝數推算出。

②相對定量：相對定量法又分為兩種。

比較標準曲線的相對定量法：在一定樣本中，靶序列相對於另一參照樣本量變化情況進行分析的方法為相對定量法。在採用該方法過程中，需要有參照物，所以較容易繪製定量標準曲線，只要將標準品稀釋度確定便可進行對比分析。

比較Ct值的相對定量法：此方法是將待測靶基因片段和內參照基因片段同時擴增，可以在兩個反應管中或者一個反應管中進行擴增反應，並且就兩者的ct值之差進行測量。在採用此方法過程中需要用數學公式進行相對量的計算，首先要假設每個循環產物增加一倍時PCR反應指數期得到Ct值對起始模板的量一個循環的估算和起始模板數兩倍相當。這種方法的前提是靶基因和內源控制物的擴增效率基本一致，所以在套用過程中效率的偏移會對實際拷貝數估計產生一定影響，因此，為了保證目的基因和內參基因的擴增效率相等應當加強對反應體系的最佳化，這也是該方法套用的難點之一。

特點

實時螢光定量PCR技術總結為以下幾點。

1.特異性強

2.靈敏度高

3.重複性好

4.檢測速度快

5.自動化程度高

套用領域

實時螢光定量PCR具有靈敏度高、特異性高和精確性高的優點，此項技術已被套用於分子生物學、醫學、食品檢測和環境監測等多個領域。

在分子生物學領域的研究套用

①定量核酸濃度：傳統方法是用瓊脂糖凝膠電泳或者分光光度計測定核酸濃度，其結果不準確而且易污染，實時螢光定量PCR可以解決這些問題，它的準確性、靈敏度高且無污染，對一些傳染性疾病進行定量分析、病原微生物和病毒含量檢測，此項技術都是首選。

②研究基因表達：套用實時定量PCR技術可以對基因時間、空間表達水平差異進行比較。例如，對特定基因用物理、化學、藥物等不同方法處理後的差異進行比較，為人們的科學研究提供依據。

③用於單核苷酸多態性(SNP)檢測分析：人們對疾病的易感性和對同一種藥物治療同一種疾病的效果是有差異性的，遺傳物質DNA的多態性RELP，STR，ABO血型和SNP是個體差異的遺傳基礎。SNP在人類基因組中廣泛存在，是人類可遺傳變異中最常見的一種，在遺傳性疾病的研究中具有重要意義。

④DNA甲基化檢測：DNA甲基化是表觀遺傳學重要的標記信息，通過實時螢光定量PCR技術獲得基因組甲基化水平數據對表觀遺傳學的時空特異性研究具有重要意義。

在醫學領域的研究套用

①用於病原體檢測：常規PCR不能定量，在操作中易污染導致出現假陽性結果，套用實時螢光定量PCR技術可以解決這些問題。目前，此項技術已套用於檢測C肝病毒、宮頸癌及其癌前病變有關的人類乳頭瘤病毒、抗結核藥物治療後定量檢測病人痰樣本病原體DNA含量，為疾病的診斷和治療提供依據。用此項技術還可以一次性檢測大量大腸桿菌樣本，簡便準確，是食品檢測方面的一個突破。

②腫瘤基因檢測：腫瘤發生機制非常複雜，發病機理尚未清楚，隨著基因分子水平研究不斷發展，腫瘤基因發生突變等遺傳學改變是致癌性發生的根本原因已被廣泛接受。癌基因表達異常和突變在多種腫瘤早期和良性階段就已出現，通過實時螢光定量PCR檢測可檢測到基因突變，準確測定其表達量，為腫瘤早發現、早診斷、早治療及療效和預後的判斷提供依據。

③用於藥物選擇和療效判斷：化療過程中主要問題是病人對化療藥物的耐藥，檢測腫瘤耐藥基因的表達水平是選擇化療藥物的依據。檢測微小殘留病變的變化情況對於調整治療策略和對病人進行個體化治療非常重要。

④用於優生優育診斷：唐氏綜合徵是由染色體異常所導致的，在產前通過實時螢光定量PCR技術做染色體核型分析，可以最大限度地防止患兒的出生，是防止此病的有效措施。此項技術還可以對孕產婦進行葉酸利用能力檢測，為孕產婦提供葉酸補充具有指導意義。此項技術對於降低嚴重缺陷兒出生率、提高人口素質起到了積極的推動作用。

在食品檢測方面的套用

①微生物：食品安全是與人民民眾生活息息相關的問題。食品在生產、儲藏、運輸、銷售等一系列過程中不可避免地存在受到微生物污染的可能性，螢光定量PCR技術用於檢測食品中的致病菌。

②轉基因：利用螢光定量PCR技術將轉基因信號擴增放大。

在環境監測方面的套用

實時螢光定量PCR技術已經被國內外套用在環境監測中，提高了監測水平。此項技術可以檢測河流中環境微生物隨著季節變化的情況。還可以用來對地表水和飲用水中致病菌進行檢測以便及時預告地表水污染情況以及採取相應有效措施避免大範圍污染。

注意事項

1.儀器擺放：實時螢光定量 PCR 儀應安放在濕度較低、灰塵較少、遠離水池的平穩檯面上，不能有強光直射，室內應通風良好，無腐蝕性氣體。

2.溫度設定：在設定螢光 PCR 程式時，要仔細核對程式中的目標溫度、恆溫時間和循環次數等參數，參數設定不正確將直接影響 PCR 檢測結果。延伸過程中要設定讀取收集螢光信號，如不設定收集螢光，將無法保存試驗數據，無法判定檢測結果，造成試驗失敗。

3.操作規範：在對樣品進行核酸提取和實時螢光擴增時要規範操作，防止樣品的交叉污染、 酶的降解、假陽性的出現。

①離心管、槍頭和 PCR 管均需要高壓滅菌或使用商品化的無 污染的離心管、槍頭和PCR 管。

②核酸提取結束後應立即進行儀器擴增，提取的核酸不可長時間置於室溫，易受空氣中酶的降解，短期可保存於 －20 ℃冰櫃，長期應保存於－70 ℃冰櫃。

③使用可高壓處理的移液器，由於移液器容易受產物氣溶膠或標本 DNA 的污染，因此要使用可高壓處理的移液器。

④嚴格按照試驗的分區進行操作，按照提取區、擴增區、檢測區單方向流動，物品、樣品和試劑不可逆向流動。

⑤操作多份樣品時，製備反應混合液，先將螢光 PCR 反應液、螢光探針和酶混合好，然後分裝到每個 PCR 管中，這樣即可以減少操作次數，避免污染，又可以增加反應的精確度。

⑥在加樣品、加蛋白酶 K 和加樣品過程中，特別注意防止樣品的交叉污染和酶的降解。

⑦操作時設立陰性及陽性對照，可驗證螢光 PCR反應的準確性和可信性。