基本介紹
- 中文名：藥物分析
- 專業代碼：100812S
- 修業年限：四年
- 學位授予門類：理學
專業介紹,藥品檢驗工作的基本程式,統計學,1 雜質分析,2 中藥分析,3 體內藥物與生物標誌物分析,4 現代藥物分析新技術,
專業介紹
本專業為2011年新增本科專業。
專業代碼：100812S，修業年限：四年，學位授予門類：理學。
藥物分析是分析化學中的一個重要分支, 它隨著藥物化學的發展逐漸成為分析化學中相對獨立的一門學科, 在藥物的質量控制、新藥研究、藥物代謝、手性藥物分析等方面均有廣泛套用。隨著生命科學、環境科學、新材料科學的發展,生物學、信息科學、計算機技術的引入, 分析化學迅猛發展並已經進入分析科學這一嶄新的領域, 藥物分析也正發揮著越來越重要的作用, 在科研、生產和生活中無處不在, 尤其在新藥研發以及藥品生產等方面扮演著重要的角色。
藥物分析
藥物分析藥品檢驗工作的基本程式
一、取樣
二、性狀觀測
三、鑑別
四、檢查
五、含量測定
六、檢驗記錄與報告
常用的藥物儀器分析方法：
[色譜法] 高效液相色譜法 氣相色譜法 離子交換法超臨界流體色譜法毛細管色譜法 薄層色譜/掃描法 凝膠色譜法 多維色譜
[其它] 生物晶片技術體內藥物分析體外分析
統計學
測量誤差：測量值和真實值之差。絕對誤差和相對誤差。
真實值：是有經驗的人用最可靠的方法對試樣進行無限次測定所得的平均值，實際上就是理論值。
系統誤差：
（1）方法誤差（2）試劑誤差（3）儀器誤差
（4）操作誤差偶然誤差：不可定誤差或隨機誤差，由偶然原因引起。可增加平得測定次數。測量值的準確度表示測量的正確性，測量值的精密度表示測量的重現性。精密度是表示準確度的先決條件，只有在消除了系統誤差後，才可用精密度同時表達準確度。
提高分析準確度方法：
1、選擇合適的分析方法
2、減少測量誤差
3、增加平行測定次數
4、消除測量過程中的系統誤差（校準儀器、做對照試驗、做回收試驗、做空白試驗）有效數字的處理：0.05060g是四位有效數字。首位是8或9，有效數字可多記一位。ph=8.02是兩位有效數字。四捨六入五成雙原則。修約標準偏差或其他表示不確定度時，修約結果可使準確度估計值變得差一點。s=2.13——2.2g檢驗法、4d法，>捨去。
藥品質量標準制定的原則和基本內容
原則：安全有效，技術先進，經濟合理。
檢驗方法：準確、靈敏、簡便、快速。
（一）、名稱
（二）、性狀：
1、外觀、臭、味和穩定性
2、溶解度：一定程度上反映藥品的純度。
3、物理常數
（1）餾程：2000規定：在標準壓力（101.3kpa）下，按藥典裝置，自開始餾出的第五滴算起，至供試品僅剩3-4ml或一定比例的容積餾出時的溫度範圍。
（2）熔點：系指一種物質固體熔化成液體的溫度，熔融同時分解的溫度，或在熔化時自初熔至全熔的一段溫度。
（3）凝點：系指一種物質由液體凝結為固體時，在短時間內停留不變的最高溫度。
（4）比旋度：具光學異構體分子的藥物，旋光性能不同。按乾燥品或無水物計算。準確至0.01.
（5）折光率：光線自一種透明介質進入另一種透明介質時，兩種介質密度不同，光的進行速度發生變化，即發生折射現象，遵從折射定律。對於液體藥品，尤其是植物油，檢查藥品的純雜程度，測定溶液的濃度。
（6）粘度：流體對流動的阻抗能力。共三法，毛細管內徑。
（7）吸收係數：物質對光的選擇性吸收波長。
（三）鑑別：用理化方法或生物學方法來證明藥品真實性的方法。對已知物。
（四）雜質檢查：有效性，純度要求和安全性。
1、有效性試驗
2、酸鹼度
3、溶液的澄清度與顏色
4、無機陰離子：氯化物和硫酸鹽。
5、有機雜質
6、乾燥失重和水分
7、熾灼殘渣：指硫酸化灰分，用於考察有機藥物中混入的無機雜質。一般限度為0.1%.
8、金屬離子和重金屬檢查每日劑量0.5g以上且長期服用的品種。
9、硒和砷：硒檢查有：醋酸地塞米松、醋酸曲安奈德及醋酸氟輕鬆。第一法：古蔡氏法10、安全性檢查
（五）含量測定或效價測定：理化方法稱含量測定生物學方法或生化方法測定稱效價測定。
1、容量分析法：化學原料藥含量測定的首選法。中和法、非水滴定法、銀量法、絡合法、碘量法、重氮化法。
3、紫外分光光度法：簡便、快速。原料藥避免。
4、氣相色譜法：分離效果優越，對含雜質和揮發性的原料藥效好。
5、高效液相色譜法：用於多組分抗生素，生化藥品或因雜質干擾測定。常規方法又難分離藥品。
1 雜質分析
1.1有機雜質分析
有機雜質的檢測方法包括化學法、光譜法、色譜法等，因藥物結構及降解產物的不同而採用不同的檢測方法。按照 QbD( quality by design) 的指導思想建立有效的分析方法並保證方法的耐用性是雜質譜分析的關鍵。主要有化學合成類藥物中有機雜質的研究，抗生素類藥物中有機雜質的研究和生物製品中有機雜質的研究等。抗生素多為半發酵、半合成產品，所含雜質的種類與含量比普通化學合成藥物複雜。氨基糖苷類抗生素沒有特徵紫外吸收，國外傾向採用電化學檢測器分析雜質，而國內的大量研究採用 HPLC-ELSD( 蒸發光散射檢測器) 檢測，亦能滿足檢測要求。
1.2無機雜質
硫酸根離子、氯離子、硫離子等在產品中的殘留一般採用藥典中的經典方法進行檢測， 硫酸根離子不具備光吸收特徵，《英國藥典》和《中國藥典》分別
採用容量法和 IP-RPLC-ELSD 測定氨基糖苷類抗生素中的硫酸根，現也可用毛細管區帶電泳( CZE) -間接紫外 檢 測 技 術 檢 測 氨 基 糖 苷 類 抗 生 素 中 的 硫酸根。
2 中藥分析
藉助於分析技術的迅速發展， 中藥藥效物質基礎研究模式有了很大的變化， 而多種方法和技術的整合為以多組分為研究對象的中藥物質基礎研究提供了良好的解決方案， 其中多組分同時分析的定性定量技術是重要的研究手段。以藥物的親和性和內在活性等基本特性為基礎的色譜分離和線上檢測技術以其快速、選擇性高、靈敏度好等優勢改變了傳統中藥活性成分的篩選和確認模式。
3 體內藥物與生物標誌物分析
如何排除生物樣品中的基質干擾， 對體內痕量藥物進行準確分析至關重要， 快速、準確、高效的生物樣品前處理技術已成為近年來體內藥物分析的研究熱點之一。液相微萃取( liquid-phasemicro-extraction，LPME) 技術集採樣、純化、富集於一體，既降低了常規液液萃取過程中有機溶劑的使用，又保留了微型化萃取的特點。UPLC-MS /MS 技術逐漸得到廣泛套用， 同傳統的 LC-MS /MS 相比， UPLC-MS /MS 顯著提高了複雜體系中藥物定量分析的速度; 2011 年運用多級串聯質譜和各種高分辨質譜進行體內藥物及代謝物的結構確證仍是體內藥物分析的研究熱點。根據目前國際上對生物樣品定量分析的相關指導原則， 專家建議《中國藥典》修訂和擴充現有的指導原則， 以適應新藥開發和仿製藥開發的需求， 重點對生物分析方法確證提出了詳細的要求[1]。
4 現代藥物分析新技術
隨著藥物科學的迅猛發展,各相關學科對藥物分析學不斷提出新的要求。由於藥物分析學的發展依賴於分析技術的進步,因此,發展現代藥物分析新技術意義重大。本文介紹近年來藥物分析領域中發展起來的幾種新技術,包括高效毛細管電泳技術、高效液相色譜-質譜聯用技術、高速逆流色譜技術和時間分辨螢光分析法,以及它們的最新套用進展[2]。隨著科學技術的發展，藥物分析已不再僅僅局限於對藥物進行靜態的質量控制，而是發展到對製藥過程、生物體內和代謝過程進行綜合評價和動態分析研究。 傳統藥物分析套用化學方法分析藥物分子、控制藥品質量，已不能滿足發展的需要。 近年來發展起來的現代藥物分析，在分析領域和分析技術上都有了很大的拓展。 隨著分析化學的進步，特別是近年來儀器分析和計算機技術的發展，為藥物分析的發展提供了堅實的基礎。 隨著藥物分析技術的不斷發展，分析方法的靈敏度、準確性及快速性已成為衡量藥物分析技術好壞的關鍵指標。 高效毛細管電泳（high performance capillaryelectrophoresis，HPCE）又稱毛細管電泳（CE）是 20 世紀末發展的一種高效、快速的分離技術，是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物。 HPCE 技術作為一種強有力的分離分析手段，在全世界範圍內得到了迅速的發展，特別是在生命科學、中藥學、食品安全等領域得到了廣泛的套用。HPCE 技術因其特別適宜快速大量地分析複雜的中藥成分而被廣泛用於中藥材鑑別和質量控制、中藥有效成分的分離與測定、中成藥和中藥製劑的分析。
高 效 液 相 色 譜-質 譜 （High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用技術是近幾年來發展起來的一項新的分離分析技術。 它將高效液相色譜（HPLC）對復 雜 樣 品 的 高 分 離 能 力 ，與 MS 具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點結合起來，在生物、藥物、臨床醫學、化工和環境等領域得到了廣泛的套用。
高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）技術是 20 世紀 80 年代發展起來的一種連續高效的新型液-液分配色譜分離技術， 最初由美國國立健康研究院（NIH）的 Ito 教授研製開發。 HSCCC 最大的優點是無需固相載體作固定相，並具有操作簡單快捷、分離純度高 、樣品回收率高 、適用範圍廣 、可一步製備純品的優點。 既適用於小量分析，也可用於規模純化，在中藥、生化、食品、天然產物化學、環境分析等領域有著廣泛的套用。
時間分辨螢光分析（timeresolved fluorescence assay，TR- FA）是近年來發展起來的非同位素免疫分析技術，是目前最靈敏的微量分析技術，被公認為是最有發展前途的一種非同位素標記分析技術。 它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量螢光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異螢光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。 隨著檢驗醫學的發展，對微量、超微量的測定會越來越多，同時放射免疫分析的污染問題會越來越被重視，因此，時間分辨螢光分析法具有越來越大的套用空間。
近年來，上述幾種新技術在各個領域中發揮著越來越重要的作用，顯示了美好的套用前景。 藥物分析中所使用的技術現在已是多種多樣，隨著其他學科的發展，老的技術將不斷更新，新的技術將層出不窮。 此外，隨著計算機技術、微製造技術、納米技術和新功能材料等高新技術的發展，它們在藥物分析中的套用不斷深入，從而帶動的分析技術和儀器也將縮短更新換代的時間，不但會具有越來越強大的智慧型，並將出現多種智慧型化、微型化、數位化、防生化、專用化的自動化分析儀器。 藥物分析工作者要不斷的充實自己，努力學習新的有關知識，認真做好自己的工作，才能跟上科學技術的發展與進步。
藥物分析檢測技術研究進展
1、 與光譜/波普相關的研究進展
（1） UV光譜、螢光光譜和化學發光光譜分析
包括紫外可見光譜、螢光光譜和化學發光在內的光譜學方法仍然在藥物含量分析中占據主要比重，例如，酶法是生物技術藥物中常用的含量測定方法之一，其判定終點時普遍採用的既是光度法。與紫外可見光譜相比，螢光光譜和化學發光可提供更高的靈敏度和特異性，同步螢光可套用於兩種及兩種以上藥物含量的同時分析。近來，UV光譜、螢光光譜和化學發光光譜多與流動注射分析（flow injection analysis, FIA）一起，用於多種藥物的含量測定。新型光學探針如pH敏感型CdTe量子點等已可作為質子探針，用於藥片中硫普羅寧的含量測定。
藥物研發領域的迅速發展也促進了對極低含量生物分子的在位、實時感測方法的發展，大部分則屬於光譜分析和免疫分析/感測技術的結合，如酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、化學發光免疫、螢光免疫方法等。量子點、金納米粒、螢光共軛高聚物等在內的新型光學探針在免疫感測方面已逐漸展開套用，例如使用近紅外區（650~900nm）發射螢光的量子點，可避免複雜基質的內源性螢光干擾。新型技術如免疫聚合酶鏈擴增（immuno-polymerase chain reaction, IPCR）、免疫滾環擴增（immuno-rolling cycle amplification, IRCA）、基於納米粒的生物條形碼分析等均可有效提高方法的靈敏度，如對前列腺特異膜抗原(prostate specific membrane antigen, PSMA)的檢測限（limit of detection, LOD）可達到amol水平，較之ELISA的靈敏度提高4個數量級。
免疫分析還可方便與各種技術整合，完成體內藥物的含量測定及藥物代謝動力學分析。例如，使用近紅外螢光標記的苯妥英類似物，結合超快免疫萃取/置換技術，可從含結合蛋白HSA的血清樣品中有效測定游離的苯妥英含量，其LOD達到570pmol/L.最近亦發展了一類新型“化學抗體”—核酸適配體（Aptamer）識別感測元件，如螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）適配體型探針或基於適配體的螢光定量PCR方法，適用於蛋白質（如重組人促紅細胞生長素，凝血酶）、小分子（如腺苷，古柯鹼）的檢測。
（2） 紅外光譜及拉曼光譜分析
在光譜相關的各種技術中, 各種分子振動技術的套用發展最為迅速。在對藥物的整體進行無損性質量控制時, 近紅外和拉曼技術最為重要, 已套用於含量測定、水分測定、結晶行為、組成均勻度和固態的物理化學性質相關的表征等。
近紅外光譜(near infrared spectrometry, NIR)指波長在 0.75~2.5 mm(波數 13333~4000 cm-1)間, 主要指由分子中 C—H, O—H, N—H 鍵的倍頻及合頻振動所產生的吸收光譜, 普遍呈現強度弱、吸收峰相互重疊等特點. 目前, 採用透射、散射、漫反射等光學檢測方法以及聯合化學計量學途徑, 如偏最小二乘法(partial least squares, PLS)、主成分分析法(principal component analysis, PCA)、人工神經網路法(artificial neural network, ANN)等, 建立標準混合物的數學模型, 可進行各組分的準確歸屬, 具有無污染、無前處理、無破壞性、線上監測、多組分同時測定、直接分析顆粒、糊狀等不透明固體樣品等優點。
近 紅 外 、 中 紅 外 ( 波 長 2.5~25 mm, 即 波 數4000~400 cm-1)和拉曼光譜在固態藥物的無損非破壞組分定量分析方面, 可提供容錯性強、可信度高的化學和空間信息。遠紅外光譜(波長在 25~1000 mm,即波數 400~10 cm-1)除用於表征多晶型的純度外, 還可用於蛋白質構象的確定、組分均勻度考察等。
多種新型拉曼光譜技術, 如共振拉曼光譜、表面增強拉曼光譜(surface enhanced raman spectrometry, SERS) 、 傅 立 葉 變 換 表 面 增 強 拉 曼 光 譜 (fourier transform SERS, FT-SERS)等, 可與 IR 相互結合得到完整的分子振動光譜信息。其中, 基於測定信號增強效應的 SERS, 檢測靈敏度高、操作方便, 已在藥物分析領域引起關注。亦可使用空間位移拉曼光譜經外包裝對藥品進行非侵入式識別。拉曼光譜、 NIR和 X 射線粉末衍射技術三者相互結合, 可對凍乾工藝中藥物的晶型進行監測。NIR 和拉曼成像技術用於分析藥物配方中活性成分的空間分布研究日呈逐漸增長趨勢。上述技術亦是甄選真/假藥的利器之一,從 2006 年以來我國 28 個省份的市(區)級食品藥品監督管理局配備的藥物快速檢測車, 其核心部件就是NIR 光譜儀。可在幾十秒至幾分鐘內完成藥品初篩,能對 18 萬條藥品質量信息數據進行識別, 對 300 多種化學藥、 200 多種中藥材進行現場快速篩查。
（3） 質譜分析
近年來, 適用於大氣壓下直接離子化的 MS 表面分析技術方興未艾, 同樣也適用於各種材料表面的藥物篩查。目前主要有電噴霧解吸電離(desorption electrospray ionization, DESI)、實時直接分析(direct analysis in real time, DART)等兩大技術和由之產生的若干分支, 如電噴霧萃取離子化(extraction ESI, EESI)、電暈放電實時直接分析電離(corona DART, CDART)、介質阻擋放電低溫離子源(dielectric barrier discharge ionization, DBDI)和低溫電漿電離(low temperature plasma, LTP)技術等。這些技術的貢獻在於依據方法適用性, 對氣、液體和固體樣品表面不做任何處理就可在大氣壓下直接進行實時分析, 幾秒鐘內便可獲得結果, 使 MS 技術滿足了現場實時快速分析的迫切需求。例如, 使用空間分辨、非共振飛秒雷射蒸發 ESI-MS 分析玻璃、纖維、鋼鐵和木材表面的藥物; 使用大氣壓下超聲噴霧 (easy ambient sonic spray ionization, EASI)MS 分析薄層色譜板上的藥物組分斑點, 僅需 N2(或空氣)輔助, 無需電壓、介質放電、 UV 或雷射光束、高溫等手段支持等。
最近, 使用表面解吸大氣壓化學電離(desorption atmospheric pressure chemical ionization, DAPCI)MS,結合 PCA 法, 成功追蹤了複雜藥品的組成、穩定性和製備工藝等信息, 以測定的阿莫西林膠囊的化學譜為例, 除準確鑑定了低至 1 ng/g(膠囊)的藥物活性成分外, 還可同時給出藥物的質譜指紋譜信息, 以反映出不同廠商來源, 而無需任何樣品前處理手段。該技術還可用於測定藥品的穩定性, 以及鑑別真/偽藥 品 等 . 針 對 組 成 更 為 復 雜 的 六 味 地 黃 丸 ,DAPCI-MS 結合 PCA 分析還可準確區分天然藥物的不同製備工藝, 如水蜜丸和濃縮丸的差異。顯示了實時大氣壓電離技術在快速鑑定藥物組成、來源、真偽方面的顯著優勢。
（4） NMR分析
NMR 是一種有效的藥物含量測定方法, 可通過比較 1H 譜的特徵譜線強度, 測定混合物中藥物的相對含量。但由於儀器價格昂貴等原因, NMR 技術目前主要用於藥物的結構鑑定, 包括體外藥物和體內藥物及其代謝產物的分析方面。其主要目標在於提高靈敏度, 如多種多脈衝技術的發展。另外, 使用微量體積的樣品管或毛細管微型探頭、低溫冷卻射頻線圈和前置放大器部件, 亦可使目前一維(1D)和 2D NMR 的靈敏度提高到nmol 級。各種 2D-NMR 技術, 如 1H1H 化學位移相關 譜 (1H1H homonuclear chemical shift correlation spectroscopy, 1H1HCOSY)、二維核 Overhauser 效應譜(nuclear overhauser effect spectroscopy, NOESY)、無畸變極化轉移增強譜(distortionless enhancement by polarization transfer, DEPT) 、 異 核 多 量 子 相 乾 譜(heteronulear multiple-quantum correlation, HMQC)、異核多鍵相關譜(heteronulear multiple-bond correlation, HMBC)已成為分子結構鑑定的重要手段, 檢測自旋偶合、偶極相互作用等核自旋間的關係, 在藥物-藥物相互作用、藥物-環糊精包合物相互作用、藥物純度及生物降解多聚物的微孔率和中孔率等的研究方面極具發展潛力。
最近, 聯合使用 2D 擴散排序 1H NMR(2D DOSY NMR), 成像型 DESI-MS 和 DART-MS 技術, 可在藥品的整體層面上判別藥物真偽情況。較之大氣壓直接離子化的實時 MS 分析技術, 2D DOSY 還可區分出各種輔料信息。例如, 對於抗瘧疾藥青蒿琥酯,DART-MS 僅可鑑別出藥物活性成分, DESI-MS 還可鑑 別 出 賦 形 劑 蔗 糖 和 乳 糖 , 亦 可 使 用 成 像 型DESI-MS 直接觀察到真偽藥物的表面均勻度分布情況; 2D DOSY 則可給出藥物活性成分和多種不同類型的有機賦形劑如蔗糖、乳糖、硬脂酸鹽、聚合物型的糊精和澱粉等有關信息, 方便的提供出藥物組成的“化學譜”。另外, 手性 NMR 和固態 NMR 技術在研究手性藥物性質和藥物晶型/多態性方面, 一直備受關注。
2、 與色譜相關的研究進展
在我國藥品質量管理法規方面, 《中華人民共和國藥典》是最高依據, 具有法律意義, 每 5 年修訂 1次。其現行版本為 2010 版, 分為一部(藥材和飲片、 植物油脂和提取物、 成方和單味製劑等)、 二部(化學藥、抗生素、生化藥品、放射性藥品及藥用輔料)和三部(生物製品), 共收錄條目 4567 種。在諸版中國藥典分析方法的發展中, 色譜及其聯用技術對藥品進行鑑別、雜質檢查和含量測定在藥典中的比重逐年增加, 目前已發展成為套用頻率最高的儀器分析方法之一。
（1） 新型色譜技術
近 30 年來, 氣相色譜(gas chromatograpy, GC)在藥物分析中展現了獨特用途, 一般用於各種原料藥及製劑中的殘留溶劑檢查、中藥中各種揮發組分的定性定量分析等。始終在藥物分析中占有主流地位的色譜技術則屬高效液相色譜 (high performance liquid chromatography, HPLC)法, 在原料藥及製劑質控、純度分析和藥物微量雜質(包括手性雜質)、降解產物、代謝產物的分析鑑定等方面得到普遍套用。根據作用機制的不同, 吸附色譜、分配色譜(正相、反相)、離子交換色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜(又稱尺寸排阻色譜)和凝膠滲透色譜等各類 HPLC 技術均有廣泛套用, 其中套用最為廣泛的仍然是反相模式(reversed phase HPLC, RP-HPLC)。近年來, 在分配色譜 基 礎 上 又 發 展 出 了 新 分 支 如 親 水 作 用 色 譜(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)和疏水作用色譜等。HILIC 作為正相色譜的一種變化形式, 但使用親水型固定相、水及與水相溶的有機溶劑則做為流動相, 其套用有增加趨勢, 其優勢主要體現在特別適合於高極性藥物和代謝產物的保留和分離及可與質譜兼容等方面。
目前研究進展集中於使用整體柱或小孔徑填料色譜柱, 以降低樣品分析時間、增加樣品通量, 即達到“快速”或“高通量”分析之目的。在可耐受約 1×108 Pa的超高壓液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)系統中, 便可使用 1.5 及 3 mm 孔徑的色譜柱, 從而更適用於快速分析複雜藥物樣品。但在超高壓力條件下, 由液體的可壓縮性所引入的非線性升溫及保留效應不可忽略, 此點在方法開發時需加以特別注意。此外, 在流動相中引入第二種有機添加劑, 用作離子對試劑、膠束或分離極酸、極鹼物質時的矽羥基掩蔽試劑亦在 HPLC 方法開發中得到重視。RP-HPLC 亦可用於納米粒封裝與釋放活性成分的研究, 如 0.1%三氟乙酸作為流動相的 RP-HPLC 方法可用於表征模擬胃腸道環境下藻酸鹽-殼聚糖納米粒對於胰島素的結合與釋放效率。亦有 2D LC(如正相二醇窄徑柱-反相整體柱)及多維 LC 用於分離分析藥物混合或提取物的報導, 可有效提高峰容量。新型色譜技術還包括各種新型的分子印跡型色譜柱的開發及體內藥物分析中的柱切換技術, 用於達到快速線上預柱切換淨化的目的。
HPLC 技術所適用的檢測器方面, 蒸發光散射(evaporative light scattering detector, ELSD)檢測器在HPLC 中的套用有增加趨勢, 特別適用於多種抗生素、天然產物及磷酸酯等的分析。其他使用到的檢測器還有示差檢測器、螢光、化學發光及電化學檢測器、電霧式檢測器 (charged aerosol detector, CAD)等。ELSD, CAD 和示差檢測器均屬於普適型檢測器, 一般用於不含或少含紫外發色團的物質的檢測。CAD較之 ELSD 具有更高的靈敏度、 寬至 4 個數量級的線性範圍和信號回響因子恆定等特點, 這兩種檢測器均為質量依賴型的檢測器, 產生的是普適性回響信號, 其強弱不取決於分析物的光譜或理化性質。因此,使用一種對照品測量而得的校準曲線, 同樣適用於其他藥物及其雜質。這就提供了在無對照品或放射性同位素標記化合物存在時準確定量的可能性。CAD與 ELSD 所共有的缺點是, 流動相組成影響檢測信號,此點可通過增加一路由相反梯度組成的流動相進行補償而解決。
（2） 色譜-質譜聯用技術
LC-MS聯用技術集合了LC的高效分離能力和MS的高靈敏度與高選擇性的優點, 已成為色譜聯用技術中的最重要分支, 系分離、鑑定各種藥物的重要手段之一, 也在天然產物化學成分的定性定量研究、 藥物的殘留物(農藥、重金屬、毒性物質等)分析及體內藥物分析如藥代動力學研究、 代謝物鑑定等中得到了廣泛套用。多維/串級質譜、衍生化試劑、小型化和基於晶片的樣品引入技術是聯用技術的發展熱點。
目前套用最普遍的是電噴霧離子源(ESI)、大氣壓化學電離源(APCI)等離子源和四極桿、 離子阱等質量分析器的有效結合。其中, 三重四極桿、 四極桿-飛行時間質譜和離子阱均可實現串級質譜的功能,便於通過碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID)進行譜峰解析, 和套用多種串級質譜模式, 如中性丟失、母離子掃描、子離子掃描等, 通過離子的多種特徵碎裂行為, 並結合代謝物在 LC 上的保留行為等特徵進行產物結構確證; 同時可通過多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)定量, 提高選擇性和靈敏度. 事實上, LC 串級質譜已成為鑑定和檢測藥物Ⅰ相和Ⅱ相代謝產物的一種主要手段。
ESI 是目前液質聯用中最廣泛套用的一種離子化方式 , 它適合於中高極性的化合物 , 尤其適於RP-HPLC, HILIC 等色譜分離技術與 MS 聯用, 亦普遍套用於藥物的 II 相代謝產物分析方面。同位素標記/稀釋技術可以拓展 LC-ESI-MS 的線性範圍及降低基質效應. 近年來發展的微噴霧和納噴霧(nanoESI)技術,更適於微量樣品的高靈敏度分析。亦有 nanoESI 與大氣壓離子遷移譜聯用測定藥物的報導。另外, 對於低極性或非極性的藥物及其Ⅰ相代謝產物的定量方面 , APCI 和 大 氣 壓 光 電 離 (atmospheric pressurephotoionization, APPI)技術具有一定優勢。
其他離子源電離技術, 如 MALDI/TOF-MS 質譜已成為測定大分子的精確質量數的準確工具, 但在小分子測定方面, 往往存在低分子量質量範圍記憶體在大量基質峰干擾、樣品製備易受基質共晶行為和均勻度影響等缺點, 近年來, 一種利用高重複率脈衝雷射器的基質輔助雷射解吸(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)源和三重四極桿(triple quadrupole, QQQ)質譜聯用方法已被初步用於 53 種化學藥物分子的定量測定, 該技術可從高基質背景的質量範圍區域內挑選出待測離子, 譜峰行為與樣品結晶質量和點樣均勻度基本無關。MALDI-QQQ-MS/MS 與ESI-QQQ-MS/MS 相比, 具有高通量、靈敏度和準確度得以提高等優點, 兩者所得定量數據也存在較好的相關性。當然, 前者在去除血清的抑制效應方面還有待加強。
但應注意到的一點是, 使用 LC-MS 用於新化學實體(new chemical entities, NCEs)及其代謝產物的定量分析時, 該技術對它們的信號回響往往存在較大差異, 通常又難於得到 NCEs 的代謝產物標準品, 此時定量分析上即會存在局限性。 CAD、放射性檢測技術等, 則可補充做為在無標準品時的代謝物定量手段。當然, 利用簇集體試劑, ESI-MS 技術可在一定程度上實現在無標準品時的絕對定量, 如達菲、鹽酸偽麻黃鹼和茶苯海明等藥物, 可與過量的 L-色氨酸,L-苯丙氨酸或潑尼松等簇集體試劑成比例混合, 有效消除了上述藥物間的高達 100 倍的自身離子化差異,準確度偏差小於 20%。雖然上述方法的準確度較之使用標準品時仍有待提高, 但對於上述述及的 NCEs代謝產物的定量問題, 無異提供了一種解決之道。
對於藥物(包括藥物製劑)中的微量未知雜質或降解產物的鑑定越來越傾向於多種技術聯合使用,以從化合物的不同性質有效闡釋, 最終得到準確的結構鑑定結果。例如, LC-MS, GC-MS 和 LC-NMR 可相互補充, 提供藥物穩定性和有關降解產物的結構信息。聯合使用製備 GC, GC-APCI-MS, 1D 和 2D NMR 及計算機輔助化合物結構解析(computer-aided structure elucidation, CASE)技術, 對複雜藥物基質中的(半)揮發性雜質進行結構鑑定。需要指出的一點是, 上述未知雜質/降解產物的最終判定“金標準”仍然應該是合成得到該物質的標準品。例如, 2005 年,Barbas 課題組研究表明, 幾種感冒藥物組方在穩定 性 實 驗 中 生 成 了 一 種 非 正 常 降 解 產 物 , 利 用LC-DAD, LC-MS, 1H NMR, 13CNMR, COSY, HMBC和 異 核 單 量 子 相 關 (heteronuclear single quantum correlation, HSQC)-NMR 等多種手段分離鑑定後, 認為系組方中的兩種藥物鹽酸去氧腎上腺素和馬來酸氯苯那敏間產生的相互作用, 生成了化合物Ⅰ。2006年, Chan 課題組就同一題目撰文, 在合成了可能的兩種產物Ⅰ和Ⅱ後並與降解物進行各種圖譜比對後,認為該非正常降解產物並非為化合物Ⅰ , 而是去氧腎上腺素和馬來酸經 Michael 加成反應後, 生成的化合物Ⅱ。化合物Ⅰ和Ⅱ的 UV, MS 圖譜及精確分子量完全相同, 但 1H 和 13C NMR 存在細微區別。
近年來, 生物質譜在大分子生物技術藥物的結構修飾與鑑定方面占據了重要位置。其中, 較之二維凝膠電泳-MALDI-飛行時間(time of flight, TOF)質譜,基於 LC-ESI 的串聯質譜技術發展迅速, 如結合多種標籤技術、多種蛋白酶酶切技術, 在電泳/色譜分離的基礎上, 可在分子量、蛋白質的定點修飾(如二硫鍵的連線位點、 PEG 修飾等)、 (N-端、 C-端)胺基酸序列、或翻譯後修飾(如糖基化、甲基化、磷酸化等)各水平上, 對蛋白質等生物技術藥物進行鑑別等項的質量控制。目前的研究熱點則在於蛋白質的相對/絕對定量方面。
（3） 與色譜及色譜-質譜聯用技術相關的新型樣品前處理方法
體內藥物分析時, 需注重的一點是有效的前處理方法。例如 , 新出現的填充吸附微萃取 (micro extraction packed sorbent, MEPS)技術, 可處理低至10 mL 的樣品, 方法步驟與固相萃取(solid phase extraction, SPE)全面兼容, 易與 GC-MS, LC-MS 整合,可實現高通量和自動化。 已用於生物樣品如血、尿中的藥物及代謝產物的前處理, 例如, 可在 2~4 min 內完成人血漿樣品中多種藥物如美托洛爾、吲哚洛爾、局部麻醉劑等的快速 96 孔高通量提取。
在對中藥進行分離分析以發現新的生物活性物質和進行質量控制時, 提取、淨化、富集步驟必不可少。目前常用的前處理方法有頂空-固相微萃取(head space-solid phase microextraction, HS-SPME)、頂空-液相微萃取(HS-liquid phase microextraction, HS-LPME)、微波蒸餾(microwave distillation, MD)、微波輔助萃取(microwave-assisted extraction, MAE)、超臨界流體萃取 (super fluid extraction, SFE) 、 加 壓 液 液 萃 取(pressurized liquid extraction, PLE)等, 分別適用於中藥的揮發性或/和非揮發性組分的提取過程。例如,HS-SPME, HS-LPME 等技術具有簡便、快速、綠色等特點, 適用於中藥中揮發性組分的分析; 2003 年以來發展的 MD 技術, 較之傳統提取精油的水蒸氣蒸餾,具有更快速、 高效和低能耗的特點。MAE 技術較之傳統的索氏提取, 具有萃取時間短、 消耗溶劑少等特點,亦可與 HS-SPME, HS-LPME 聯合使用分析揮發性組分; 在 PLE 技術中, 高溫高壓的存在加快了分析物和溶劑間的傳質過程, 萃取效率隨之增加. MAE, SFE和 PLE 均可與色譜技術聯用, 進行對中藥組分的定量分析。
（4） CE 及CE-MS 聯用技術
從 20 世紀 80 年代末期以來 , 毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)技術以其高效、快速、微量、多模式等特點, 迅速在藥物分析領域得到廣泛套用, 主要模式包括毛細管區帶電泳、非水 CE、微乳液電動色譜、毛細管等速電泳、毛細管電色譜、免疫親和 CE 等, 諸多檢測技術如二極體陣列、雷射誘導螢光(laser-induced fluorescence, LIF)、質譜、電荷耦合器件(charge-coupled device, CCD)、化學發光、非接觸電導等均有涉及, 以達到高靈敏度或獲得分析物的三維、結構信息。目前較為成熟的 CE-MS 方式是 CE-ESI-線性離子阱-MS 聯用模式, 主要套用於手性拆分、藥物雜質檢查、藥物活性成分分析及其體內藥物分析測定等。
CE 及 CE-MS 在藥物分析中最常見用途是用於手性物質的分離與純度分析。多以利用手性選擇劑來構建手性環境, 最常見的手性選擇劑仍然是天然或修飾的b-環糊精。除可溶性的手性選擇劑之外,手性選擇劑塗覆分散型多壁碳納米管上亦可增強 CE拆分效果。各種離線和線上的樣品處理技術、基於電泳和色譜原理的在柱樣品富集技術、 除 UV 檢測器外的其他檢測手段、分析物衍生化技術等, 均可用於在CE 手性拆分中提高靈敏度, 實際上, 這也是目前CE 手性拆分領域的發展趨勢之一。幾種處理/富集方法的聯用, 如樣品大體積堆積技術、線上推掃技術結合 CE-LIF 模式, 已可使衍生化胺基酸的 LOD 達到亞nmol/L 水平, 這就使複雜生物基質中的實際對映體分析和純度控制成為可能。
由於生物工程技術的飛速發展, 抗體類藥物增長迅速, 至 2010 年 6 月已有 26 種單克隆抗體(monoantibody, mAb)被 FDA 批准用於臨床治療。在mAb 的結構中, 其糖鏈部分與體內生物學活性的發揮密切相關, 不同真核細胞系、不同工藝表達所得的單克隆抗體, 其寡糖糖譜常存在差異。但因其寡糖鏈具有高度的微觀不均一性, 對 mAb 的糖基部分進行完全表征難度較高。此方面, CE 技術, 包括全成像式等電聚焦分析等電點、膠束電動毛細管色譜(micellar electrokinetic chromatography, MEKC)分析糖基化比例、 CE-LIF 結合衍生化技術分析糖譜及 CE-MS 分析寡糖鏈連線及組成等則對於評價抗體型藥物的糖基化, 進行全方位的質量控制提供了較好的系列技術手段。
（5） 微流控系統
微流控技術因具有分析微型化和實驗通量化的特點, 已成為藥物研發套用中具有潛在價值的工具。微流控系統中可包含多種組件, 如泵、閥、混合器和加熱器等, 從而便於操縱流體。較之傳統途徑, 微流控通道僅使用極少試劑、反應時間快速, 更適於進行高通量的實驗。微流控系統可分為基於電滲流為驅動力及基於微泵為驅動力的兩大類, 前者即為晶片CE, 也是微流控系統發展迄始的表達形式。幾平方厘米的玻璃或塑膠晶片上, 刻蝕數十至上百條電泳通道, 可實現 8, 24, 96 甚至 384 條通道的 CE。晶片CE 可實現高通量和自動化, 在藥物篩選、 DNA 序列分析等方面有著極好的套用前景。
3、 其他相關技術
（1） 電化學分析/感測
目前套用最為成熟的電化學分析技術仍然是差示脈衝極譜法(differential pulse polarography, DPP),其他基於伏安法的分析技術, 如差示脈衝伏安法、循環伏安法和快速傅立葉變換循環伏安法, 法拉第阻抗光譜法等也有套用. 除各種電化學分析技術外, 各種新型電化學感測器的設計非常踴躍, 如多壁碳納米管修飾玻碳電極測定四環素類藥物等。
（2） 熱分析
2005 版中國藥典附錄Ⅷ Q 即已記載了 3 種用量少、快速、簡便、準確的熱分析法, 分別是將檢測體系 在 程 序 控 溫 過 程 中 熱 量 變 化 的 差 熱 分 析(differential thermal analysis, DTA)、差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)和測量被分析樣 品 在 加 熱 過 程 中 重 量 變 化 的 熱 重 法 (thermal gravimetric analysis, TGA)。DSC 是最常用的晶型和多態性測定方法。已用於藥物-藥物、藥物-賦形劑間的相互作用等。 藥物分析中 DSC-TGA 法多聯合使用,用於確定藥物的熔點、純度、結晶度等熱力學特徵數據及藥物和配方的穩定性分析, DSC-TGA 法還可用於判斷藥物分子中存在的是結晶水還是吸附水, 以及給出結晶水的個數。DSC, TGA 和 X 射線粉末衍射技術聯合, 可用於藥物分子雙氯芬酸在不同晶型中固有溶解度的分析。用 DTA 和 DSC 方法, 還可測定出同一藥物不同差向異構體的純度等。使用掃描熱顯微成像技術和局部熱傳導率分析技術, 可給出多組分如藥物撲熱息痛和輔料羥丙基甲基纖維素在藥片中分布的三維信息。
（3） 容量分析方法
除上述各種儀器分析方法技術外, 不容忽視的一點是, 各種容量分析方法如滴定分析等在現代藥物的含量測定方法中仍占據重要地位。其特點在於準確度高、所用設備較為簡單, 故在各版藥典中均占有較高比重。目前的發展趨勢則在於更低濃度、具備多化學計量點的體系的準確滴定。對於藥物中的微量水分, 多使用卡爾費休法, 於無水甲醇中進行容量法滴定, 目前則集中於解決難溶性藥物中水分的準確定量問題。
