結構光照明螢光顯微技術:簡介,發展歷史,結構光照明,工作原理,基本成像原理,非線性

結構光照明螢光顯微鏡是基於常規螢光顯微鏡，通過對其照明方式的改進，以特定結構光成像，從而突破衍射極限，獲得高解析度樣品信息，進而由傅立葉變換獲得樣品顯微圖像的一種光學顯微鏡。

基本介紹

中文名：結構光照明螢光顯微技術
外文名：Structure Illumination Microscopy
縮寫：SIM
發明時間：2005年
發明者：Mats Gustafsson
技術分類：超解析度顯微成像技術

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簡介

發展歷史

照明在光學顯微鏡中一直起著十分重要作用。在一個多世紀前提出的柯勒照明，一直是光學顯微鏡的主要照明技術。近幾十年來，發展出許多新的照明技術，意在提高顯微鏡的某些成像能力。然而，它們中的大多數不適合在寬場條件下觀察，因此在顯微鏡使用廣泛的領域，如細胞生物學和微尺度輪廓測量中受到了限制。2005年由Mats Gustafsson開發並提出的結構光照明顯微方法，為寬場顯微鏡技術實現了解析度性能上的突破。此外，它也與現有顯微鏡兼容。該方法通過在樣本本身或其圖像上疊加明確定義的圖案來修飾照明光，對所得圖像套用計算技術以去除結構光照明的影響，並獲得預期的高質量圖像。這種方法在過去十多年間迅速發展，已經成為細胞生物學和工程學中對微觀物體進行光學切片、超解析度成像、表面分析和定量相位成像的關鍵照明技術。

結構光照明

結構光照明是一種通過改變照明光空間結構的照明方式，通常照明的結構光是一個載頻條紋，該照明方式可套用於角度、長度、振動等的測量，並廣泛套用於三維成像。這種特別的照明方式通過形成摩爾紋（Moire fringes）來使得在常規照明方式下無法分辨的一些高解析度信息得以變得可見。

摩爾紋產生原理

實際實驗過程中在照明光路中插入一個空間光調製器（如光柵，或者數字微鏡陣列DMD等），照明光受光柵的調製後經物鏡投影在樣品上，這樣在樣品的焦平面收到調製光的照射，在遠離焦平面也不受影響，最終調製光所產生的螢光信息通過成像系統被CCD接收，之後通過傅立葉變換將空間域和頻域進行變化，從而獲得圖像。

工作原理

基本成像原理

普通光學顯微鏡的成像過程可以通過點擴展函式進行描述，通過對點擴展函式進行傅立葉變換，可獲得顯微系統的光學傳遞函式。由於衍射極限的存在，光學傳遞函式限制了通過顯微系統的信息量，只允許低頻信息通過系統，濾除代表細節的高頻信息，即限制了系統的解析度。

2D-SIM突破衍射極限原理

結構光照明顯微鏡實現超分辨的原理，就是利用特定結構的照明光在成像過程把位於光學傳遞函式範圍外的一部分信息轉移到範圍內，利用特定算法將範圍內的高頻信息移動到原始位置，從而擴展通過顯微系統的樣品頻域信息，使得重構圖像的解析度超越衍射極限的限制。

對於光學顯微鏡系統，光學傳遞函式的三維結構是圓環結構，在零頻位置存在凹陷。凹陷帶來的後果就是CCD 上記錄的信息不僅包含物鏡焦平面上的樣品信息，同時包含焦平面外的樣品信息。由於受到焦平面外的信息的干擾，常規螢光顯微鏡無法獲得層析圖像。三維結構光照明顯微鏡提高解析度、獲得層析圖像的原理，就是利用特定結構的照明光來獲得樣品的高頻信息，採用特定算法在橫向和縱向上擴展樣品頻域信息的同時彌補凹陷帶來的影響。