三維光學顯微成像

三維光學顯微成像是利用光學層析技術獲取樣品三維圖像的光學顯微成像方法。實現三維光學成像的顯微鏡必須具有區分成像焦面的有用信號與焦面外的背景信號的能力，即光學層析能力。通過移除焦面外的信號，顯微鏡可以獲取厚樣品中一系列的薄層信號。基於這些二維的圖像，計算機技術可以重構出反映樣品信息的三維圖像。獲取層析能力主要有兩種方式：一種方式是在照明的過程中不產生焦面外的背景信號；另一種方式是在探測前或探測後移除焦面外的信號。基於這兩種方式，科學家們發展出了不同的光學顯微成像方法。根據光學層析機理的不同，這些方法主要有雷射共聚焦顯微成像、非線性光學顯微成像、結構光照明顯微成像與光片照明顯微成像。[1-3]

雷射掃描共聚焦顯微成像

圖1 共聚焦顯微成像示意圖

在傳統的寬場顯微成像中，整個樣品被光源均勻地照亮，樣品不同位置發出的螢光同時被探測器接收，其中包括大量的焦面外的信號。在對厚樣品成像時，焦面上的信號只占探測信號的一小部分，因此圖像會非常模糊。不同與寬場成像，雷射共聚焦顯微成像採用點掃描的方式，並且在探測器前成像焦面的共軛面上放置小孔，以阻擋焦面外產生的信號進入探測器（如圖1所示）。由於小孔的作用，只有焦平面上的信號可以被探測到，因此這種成像方式具有層析能力。

共聚焦成像能夠獲取高質量的圖像，目前被廣泛套用在科學與工程領域中，其典型套用包括生命科學、半導體檢測與材料科學。

非線性光學顯微成像

1. 雙光子激發顯微成像

雙光子激發顯微成像是利用雙光子激發的非線性效應實現其內在的層析能力的。雙光子激發的概念最早由Maria Goeppert-Mayer於1931年在她的博士論文中提出。

圖2 單光子與雙光子激發的能級和效果示意圖

螢光物質同時吸收兩個光子後能夠激發出螢光光子，螢光光子的能量比這兩個光子的能力要高。由於同時吸收兩個光子的機率比較低，這種成像採用聚焦脈衝雷射的方式來激發螢光，以在短時間內在焦點處聚集大量的激發光子。雙光子激發依賴於同時吸收，激發的螢光強度正比於激發光強度的平方。這種非線性效應使得只有在焦點處很小的體積內能夠激發螢光，樣品其它區域不能夠激發螢光，因而這個成像方式具有內在的層析能力。圖2中對比了單光子與雙光子激發的能級躍遷和激發效果。

雙光子激發通常採用近紅外波段的雷射進行激發，這樣成像的穿透深度比較深，光漂白也比較小，適合於對活體生物組織進行非侵入式的光學成像。目前雙光子激發顯微成像被廣泛套用在生理學、神經生物學、胚胎髮育學中。

2.二次諧波顯微成像

圖3 二次諧波產生的能級示意圖

二次諧波（也稱做“倍頻”）是一種非線性的光學效應。在這種現象中，同一頻率的兩個光子與非線性材料進行相互作用後被“結合”產生一個光子。這個光子具有兩倍的原光子的頻率，波長精確地為原光子波長的一半（如圖3所示）。二次諧波成像是基於二次諧波效應的成像方法。與螢光成像的對比度來源於螢光分子密度不同，其對比度來源於樣品產生二次諧波能力的變化。

與雙光子激發成像一樣，二次諧波成像也使用近紅外波段的脈衝雷射，因此二次諧波成像具有無需標記和底損傷性的優點，其常常與雙光子激發成像一起用來對活體組織進行多模式成像。二次諧波具有偏振各向異性的特點，因此可以用於探測蛋白質分子的排列方向。

結構光照明顯微成像

4 結構光照明顯微成像示意圖

結構光照明顯微成像是在寬場成像的基礎上發展出的三維層析成像方式。在這種成像方法中，照明光路中放置了光柵，最終在物鏡後成像焦面上產生了強度為正弦分布的照明。通過改變正弦分布的相位並記錄調製後的反射或螢光圖像可以提取出成像焦平面的圖像和抑制焦面外的模糊（如圖4所示）。這種層析能力的獲取是基於後期的計算處理。這種層析成像方法為後來的超分辨技術奠定了物理基礎。

由於只需要對傳統的寬場顯微鏡進行照明光路的改進便可以獲取層析能力，結構光照明層析成像具有成本低的優勢。目前發展的快速結構光照明成像可用於對生物組織動態事件進行監測。

光片照明顯微成像

圖5 光片照明顯微成像示意圖

光片照明顯微成像，也稱作選擇性平面照明顯微成像。與傳統的落射式照明成像不同，這種成像方式是從樣品的側面進行照明，照明方向垂直於探測方向。這樣樣品中只有一個薄層被照亮，使得成像具有層析能力，移動光片的位置可以獲取樣品的三維圖像。產生光片的方式有主要有兩種：第一種是用柱透鏡使光束在一維上聚焦；第二種方式是在一維上掃描光束形成光片。

由於只有需要觀察的平面被照明，這種成像方法減少了對樣品的光漂白，適合應於對樣品的長時間的成像。另外由於使用面陣探測器進行成像，其成像速度較快。目前，光片照明成像通常被套用在發育生物學中，用以對胚胎的發育進行長時間的觀察。