結核分枝桿菌DnaA乙醯化修飾與DNA複製調控的研究

《結核分枝桿菌DnaA乙醯化修飾與DNA複製調控的研究》是依託上海交通大學，由姚玉峰擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：結核分枝桿菌DnaA乙醯化修飾與DNA複製調控的研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：姚玉峰
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

結核桿菌感染宿主後，大多以潛伏感染的形式存在於宿主體內，此時DNA複製變緩或停止，但其調控機制還不清楚。我們利用蛋白質組學技術發現細菌中存在廣泛的蛋白質乙醯化修飾現象，並調節蛋白質的各種功能。DnaA是DNA複製起始過程中的關鍵蛋白，前期實驗表明結核桿菌DnaA的ATP結合域（Walker A motif）的賴氨酸殘基存在乙醯化修飾現象。該結合域的賴氨酸殘基的ε-NH2與底物ATP在空間上非常接近。因此我們提出假說：在結核桿菌中DnaA的ATP結合域通過賴氨酸殘基的乙醯化修飾改變DnaA活力，並精細調節結核桿菌DNA複製。本課題將擬綜合採用體外和體內細胞模型的研究策略，探討結核桿菌DnaA的乙醯化修飾與DNA複製的內在關係，深入研究結核桿菌DNA複製起始調控的機制，充分理解結核桿菌潛伏感染過程中DNA複製的調控，為結核患者的臨床治療以及新型抗結核藥物的開發提供理論基礎和實驗依據。

結題摘要

通過三年的努力，我們按照原計畫，對細菌複製起始蛋白DnaA的乙醯化及功能進行了詳細的研究，同時拓展了結核桿菌部分的工作，研究了結核病人血清的代謝組學變化，為結核病的診斷開拓了新的思路。 我們通過研究發現，DnaA可以在體外被乙醯化酶Pat及去乙醯化酶CobB修飾。檢測生理狀態下純化出的DnaA乙醯化程度，發現從遲緩期到平台期，DnaA乙醯化程度升高，且與WT相比，∆cobB菌株DnaA乙醯化程度升高，∆pat菌株乙醯化程度下降。表明生理狀態下CobB/Pat調控DnaA乙醯化修飾。流式細胞檢測表明，與WT相比，∆cobB菌株複製起始減弱，∆pat菌株複製起始增強。這表明CobB/Pat可能通過影響DnaA乙醯化程度來影響DNA複製起始。 通過LC/ESI/MS質譜鑑定，DnaA的23個賴氨酸位點中被鑑定出有16位點被乙醯化修飾，其中有比較保守的Walker A上的K178位。對該位點進行定點乙醯化修飾後檢測其功能，發現DnaA(K178Ac)對ATP/ADP結合能力下降，ATPase活性也受到影響，對複製起始位點結合能力亦減弱。除此之外，我們還發現CobB/Pat對dnaA promoter的自調控也有影響。至此，我們認為DnaA的乙醯化修飾對DNA複製起始有負調控作用，其中K178位點發揮關鍵作用，且乙醯化酶Pat及去乙醯化酶CobB也參與了這一調控。 另外，採用核磁共振與多元數據分析技術相結合的方法，對結核病人及健康對照組血清樣本進行了研究。結果發現結核病人血清中某些小分子代謝產物的濃度發生了較大變化，在結核病人血清中濃度升高的有： 1-甲基組氨酸、乙醯乙酸鹽、丙酮、谷氨酸鹽、谷氨醯胺、異亮氨酸、丙酮酸、酪氨酸；濃度降低的有：丙氨酸、甲酸鹽、甘氨酸、丙三基膽鹼磷酸和低密度脂蛋白。進一步對差異代謝產物進行代謝通路富集分析發現與健康對照組相比較，結核病人機體內的蛋白質合成通路、苯丙氨酸-酪氨酸代謝通路、氨循環、丙氨酸代謝、尿素循環、酮體代謝、葡萄糖-丙氨酸循環通路等代謝通路發生了變化。綜上所述，結核病人血清具有特徵的性代謝圖譜，該結果能夠為結核病的發病機制、病情發展變化及治療情況的評估提供重要的依據。