結核分枝桿菌sRNA功能及參與多藥耐藥和毒力調控研究

《結核分枝桿菌sRNA功能及參與多藥耐藥和毒力調控研究》是依託中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院，由李艷擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：結核分枝桿菌sRNA功能及參與多藥耐藥和毒力調控研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：李艷
• 依託單位：中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院

中文摘要

sRNA（small regulatory RNA）是細菌中的調節因子，參與細菌的諸多重要生理過程，研究sRNA及其靶標mRNA的功能，將有助於闡明結核桿菌的轉錄後調控機制。本研究採用生物信息學預測結核分枝桿菌H37Rv的sRNA基因，高通量測序篩選sRNA；合成sRNA的反義鏈序列，以同位素標記作為探針，Northern Blot和實時定量PCR驗證sRNA基因的表達；生物信息學預測sRNA的mRNA靶標，Gel Shift方法研究sRNA與mRNA靶標的結合；將合成的sRNA序列克隆到穿梭載體中，電轉化的方式轉入結核桿菌，使相應sRNA過表達，觀察重組子生長狀況及毒力、抗藥性的變化，從而探究該靶標mRNA的功能；收集臨床多藥耐藥菌株，研究其與敏感菌sRNA及其靶標的表達差異。綜合以上數據，研究sRNA及其靶標功能，為揭示結核桿菌致病機理、多藥耐藥產生和抗結核藥物的開發提供理論依據。

結題摘要

sRNA（small regulatory RNA），也稱非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA），是細菌中的新型調節因子。它們由基因組編碼，但是絕大多數不編碼蛋白產物，通過與mRNA分子互補配對作用或者影響蛋白分子的活性，參與細菌的重要生理過程。目前結核病的防控形勢依然很嚴峻，基於分子水平研究結核分枝桿菌致病機理及多藥耐藥性的產生具有重要意義。結核桿菌可根據外界環境狀態和免疫狀態，促使sRNA調節自身基因表達，其在宿主體內的潛伏狀態和耐藥性的發生可能與sRNA的功能有關。結核分枝桿菌中僅有少量已經明確序列並被鑑定的sRNA，而對其功能和調控網路更是知之甚少。 本研究採用高通量測序與生物信息學結合預測結核分枝桿菌新的sRNA 1594條，並分析了它們在分枝桿菌中的保守性。建立結核分枝桿菌的鐵剝奪模型後，提取總RNA建立了鐵剝奪模型的轉錄組文庫，分析得到缺鐵環境下，結核分枝桿菌的轉錄組差異基因109個，差異sRNA 4個，並採用Northern blot 驗證了sRNA-cs01，同時，啟動子驗證試驗證實cs01和上游基因Rv3098A共轉錄。 用氨基糖苷類藥物鏈黴素和卡那黴素分別作用於結核分枝桿菌，並建立轉錄組測序文庫，發現差異sRNA共10條，其中位於基因組1512822-1513027的ms28是鏈黴素和卡那黴素刺激後共同下調的sRNA。通過軟體和位置分析預測了每條候選sRNA的靶基因。採用Northern blot 和qRT-PCR檢測鏈黴素和卡那黴素刺激後sRNA表達量變化，7條差異sRNA與分析結果一致。通過改造穿梭質粒PMV261，得到了ms28的過表達載體，電轉入結核分枝桿菌從而構建了過表達株，經過表型分析和qRT-PCR檢測，發現ms28高效表達後，前期預測的ms28靶基因中有6條上調，同時保守基因rrs、prpC、groES也上調，與電轉入空載體的菌株相比，ms28過表達株與生長曲線左移，平台期提前3-4d。 本研究探索了結核分枝桿菌sRNA與物質代謝和耐藥性產生的關係，並通過sRNA的靶標分析和功能試驗揭示了初步的調控網路，為探索結核病耐藥性產生和鐵離子轉運的sRNA調控機制提供了依據。