《結核分枝桿菌壓力反應因子SigC介導的分子致病機制研究》是依託復旦大學,由范小勇擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名:結核分枝桿菌壓力反應因子SigC介導的分子致病機制研究
- 依託單位:復旦大學
- 項目類別:青年科學基金項目
- 項目負責人:范小勇
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
研究顯示,sigC僅存在於致病分枝桿菌中,基因敲除sigC 的結核分枝桿菌毒株在小鼠與豚鼠體內毒力明顯喪失,提示SigC與結核桿菌致病性密切相關,然而其分子機制尚不明了。此前,我們基因組學研究發現無毒株H37Ra sigC基因上游啟動子存在突變,並推測可能與其體內減毒相關。接著,我們套用定量RT-PCR和報告基因表達方式均直接證明了該啟動子突變確實引起了H37Ra在細胞內生長過程中sigC基因表達下調,故我們擬在此基礎上進行深入研究。擬利用M.smegmatis和H37Ra構建不同SigC表達強度的Knock-in菌株,並綜合套用螢光定量RT-PCR、Microarray、免疫共沉澱、雙向蛋白電泳及質譜等技術分析其在體外和巨噬細胞內受SigC調控的基因差異表達情況,旨在分析和鑑定與SigC相互作用的關鍵蛋白和受其調控的毒力基因或調控因子,從而在分子水平解析SigC介導的結核桿菌致病機制。
結題摘要
已知SigC因子參與眾多與結核分枝桿菌細胞加工過程相關重要基因的表達調控,基因敲除SigC則導致有毒株在小鼠或豚鼠體內毒力喪失,且SigC因子僅在致病分枝桿菌(如結核桿菌、M. leprae等)中存在,而在非致病分枝桿菌(如M. smegmatis)中缺失,這些均提示SigC因子與結核桿菌致病性密切相關。我們早期的基因組學研究解析了結核桿菌無毒株H37Ra的完整基因組序列並發現sigC基因啟動子部位存在點突變,作為一個整體代謝調節因子,我們推測該啟動子突變可能會影響其轉錄水平,而SigC表達量的改變則可能會直接或間接影響結核桿菌某些毒力相關基因的轉錄調控,從而引起H37Ra菌株毒力的改變。為此,我們分別套用螢光定量RT-PCR和啟動子活性分析實驗證明了H37Ra sigC基因及其啟動子活性儘管在體外表達增高,卻在體內表達下調。接著,我們系統構建並完善了分枝桿菌同源可控、定向表達等多種不同高效表達系統,可實現結核桿菌蛋白在分枝桿菌中以不同的水平及不同方式進行表達。同時,我們以M. smegmatis (相當於sigC Knock-out菌株) 和H37Ra (相當於sigC Knock-down 菌株)為模式菌,利用上述表達系統構建了SigC過表達的Knock-in菌株,將重組菌株體外培養後製備總蛋白,以雙向電泳(2D-PAGE)分離差異表達蛋白並以質譜分析受SigC調控的蛋白表達情況,結果表明在SigC過表達的重組M. smegmatis和重組H37Ra菌株中分別鑑定出了9個和10個差異表達蛋白,這些蛋白多為分枝桿菌代謝過程中的一些關鍵酶類。接下來,我們還通過免疫共沉澱分析了與SigC相互作用的蛋白,結果並未檢測到該類蛋白,提示SigC不是在翻譯水平進行調控的。最近有研究鑑定了sigC的兩個啟動子序列並證實了sigC是在轉錄水平受調控且非自我調控(Chang A, Smollett KL, et a1. Tuberculosis. 2012;92(1): 48-55),因而使得我們在蛋白水平分析與SigC相互作用蛋白的種種努力不得不終止。不過,我們還可構建H37Rv的sigC基因敲除菌株,分析其在缺氧、PBS飢餓、酸性、H2O2等不同環境壓力下的差異基因表達情況或感染巨噬細胞前後炎性細胞因子表達的改變情況,嘗試從壓力環境條件下解釋SigC的可能毒力機理。