《細胞周期調控激酶Cdk對Wnt信號通路的調控機制研究》是依託清華大學，由柳林華擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：細胞周期調控激酶Cdk對Wnt信號通路的調控機制研究
- 依託單位：清華大學
- 項目負責人：柳林華
- 項目類別：青年科學基金項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
Wnt通路是一條在進化上高度保守的信號通路，它在胚胎髮育中起關鍵作用。Wnt通路相關因子的缺失和異常將導致發育不全或相關疾病。Dapper1和Dishevelled是Wnt通路中關鍵的作用蛋白。我們的前期研究表明，細胞周期調控激酶(Cdk)在Wnt信號刺激下，可磷酸化Dapper1及Dishevelled。在本項目中，我們將進一步結合多種生物化學，細胞生物學方法和實驗技術，深入研究磷酸化修飾在細胞周期調控及Wnt信號通路中的作用機制。並且，通過動物實驗進一步觀察Dapper1和Dishevelled的磷酸化在相關疾病及胚胎髮育過程中的作用。通過本項目的開展，我們希望闡明細胞周期調控和Wnt信號通路互動（cross-talk）的分子機理及其在胚胎髮育及相關疾病中的作用。
結題摘要
本人嚴格按照年度計畫進行了本項目的研究，目前任務書中的研究內容基本完成，取得了如下的成果。 我們首先進行了細胞周期調控激酶（Cdk）對hDpr1和Dvl蛋白的磷酸化鑑定研究。已經成功鑑定出能被Cdk磷酸化的,hDpr1的2個磷酸化位點，並探討了磷酸化對Wnt信號通路的影響。為了觀察hDpr1的磷酸化對Wnt信號通路的影響，利用定點誘變PCR技術，製備了一系列的hDpr1的不能被磷酸化的非磷酸化突變體（hDpr1-SXA, SYA, SX,YA）和模擬磷酸化的突變體（hDpr1-SXD, SYD, SX,YD）。利用一系列的突變體通過Wnt報告基因表達的影響，驗證了Cdk對hDpr1抑制Wnt信號的作用具有抑制作用。同時，發現這種磷酸化還直接影響細胞周期的進程。 另外，我們還探討了Dvl蛋白的磷酸化。但是因為Dvl蛋白的磷酸化位點非常多，利用質譜的方法驗證位點有一定難度，這一研究仍在進行中。但是我們利用軟體分析方法預測了可被Cdk磷酸化的潛在位點並對其功能進行了研究。我們在研究中主要採用了抑制劑和干擾的方法，在細胞水平上觀察了Cdk對Dvl2的磷酸化及其功能的研究。我們發現，Cdk的抑制劑Roscovitine預處理HEK 293T細胞1個小時，明顯抑制了Wnt3a CM刺激誘導Dvl2蛋白的磷酸化及抑制了Wnt報告基因的表達。另外，特異性敲除Cdk1, 2對Dvl2蛋白的磷酸化及Wnt報告基因表達的影響結果表明，Cdk2直接影響Dvl2蛋白的磷酸化以及Wnt信號通路。同時，還利用激活型的Cdk2及抑制型的Cdk2質粒觀察了對Dvl2蛋白磷酸化的影響。發現激活型Cdk2在細胞水平上能增強Dvl2的磷酸化。通過免疫共沉澱的方法我們還觀察到Dvl2和Cdk2在細胞內的相互作用。而且，有趣的是，這些Dvl2蛋白的磷酸化是周期依賴性地發生，分裂期Dvl2蛋白的總量及磷酸化水平均顯著性地下調。並且，Dvl2將參與細胞周期的進程中影響周期的進行。基於軟體預測的潛在磷酸化位點，我們製備了一系列的突變體，發現磷酸化能夠增強了Wnt信號通路。 以上研究結果表明，Cdk可以通過磷酸化hDpr1和Dvl蛋白影響Wnt信號通路，hDpr1和Dvl反過來還參與到細胞周期中影響周期的進程，形成Wnt信號與細胞周期間的互動。
