基本介紹
- 中文名：相襯顯微技術
- 外文名：Phase-contrast microscopy
- 領域：光學
簡介,歷史,原理知識,技術細節,圖像外觀,
簡介
光線在穿過非真空介質時，會與介質發生作用從而產生幅度和相位的變化，這種變化與介質的性質相關。幅度的變化通常是由於介質對光的吸收，變化程度與波長也就是光的顏色相關，而介質的厚度、折射率的變化會導致光線相位的改變。人的眼睛僅能測量到達視網膜的光線的能量強度，而很難觀察到相位的改變，普通的光學顯微鏡也無法檢測相位的改變。然而相位的變化通常也會攜帶相當多的信息，但是在對光線進行測量的時候這部分信息就全部丟棄了。為了使相位變化的信息可以被觀察到，就需要將穿過樣品的光線與參考光源l相結合，相干的結果可以顯示出樣品的相位結構。
歷史
相襯顯微技術是二十世紀三十年代弗里茨·澤爾尼克在研究衍射光柵的時候發明的。在研究中，他認識到與參考光干涉是很有必要的，而為了最大化對比度，需要向參考光中引入相移，這樣可以產生完全的相消干涉。隨後，他認識到相同的技術可以用於光學顯微技術。首先需要在玻璃上精確蝕刻圓環，當將玻璃插入顯微鏡的光路中的時候，就會產生所需要的相移。這個技術稱為相襯技術。
光學顯微鏡觀察的許多對象如原生動物、細菌、精子的尾等等細胞結構在染色以前都是透明的。染色是一個非常困難和耗時的過程，而且有時還會對標本產生傷害。然而，觀察對象的密度和成分不同經常會使光線在穿過它們的時候產生不同的相移，因此他們有時候也被稱為相位物體。使用相襯技術可以使這些結構顯示出來，同時允許對活體標本進行研究。
相襯技術是顯微技術中的一個重大進步，它的發明人澤爾尼克因此榮獲1953年的諾貝爾物理學獎。目前，在大多數高級光學顯微鏡中都使用了相襯技術，而它也被廣泛套用於為透明標本如活體細胞和小的器官組織提供對比度圖像。
原理知識
首先光線從照明用的燈絲內的一點射出，由場透鏡精確的聚焦在聚光器處的匹配環的開放處。由於這個位置處在聚光器的前焦平面，光線在通過聚光器後將變成平行光。假設這兩束光線在顯微鏡的載玻片的位置不發生反射和折射，它們將平行的射入物鏡。由於所有的平行光都會聚焦在後焦平面上，物鏡的後焦平面是聚光器的前焦平面的共軛平面。而實際上光線通過標本以後將會發生反射和折射，而後將在物平面的共軛平面處聚焦。為了完成調整相位的需求，需要在此處添加一塊相位板。
如果要使相襯顯微鏡清晰成像，需要將這兩個部件準確的放置在一起，中心也需要對準。在調整的過程中，使用相位對中望遠鏡暫時的取代一個目鏡，讓物體的像聚焦在相位板上，然後通過望遠鏡觀察將匹配環和相位板對應的環調整到同心位置。
曾經有過一種有趣的相襯設計的變種，在這個設計中，匹配環被一個十字形的傳輸縫代替，而位於物鏡共軛平面的相位環被一個十字形的相位板代替。這個設計的優點是在所有的相位物體的放大過程中只需要一個縫狀光圈，而十字的形狀使得重新對齊中心和旋轉對齊非常容易，因此調整不再需要使用對中望遠鏡了。
技術細節
相襯顯微鏡的原理圖中省略了一些細節。首先，聚光環僅僅是一個位於平面中央的小光圈，而相位板也僅僅覆蓋在了平面中央的小光圈上。
聚光鏡和相位板
聚光鏡和相位板為了進一步的理解相襯照明的工作原理，我們來研究兩個波陣面（如右圖）。平面1處在聚光器的前焦平面上。光線通過小孔S射入，通過聚光器射出後形成平行的波陣面。當這些平面波碰到物平面2處的位向物體O的時候，一些光在穿過標本時被折射。假設標本不會顯著的改變入射光的幅度，而僅僅改變了它們和參考光之間的相位關係，新產生的球面波前在從標本射出後相位將被延遲90° （λ/4）。注意到現在有兩種類型的波，作為參考光的S波和折射光D波，它們之間存在這90° 的相差。物鏡將D波在主像平面，也就是圖中的平面4的內部聚焦，而S波將在其後焦平面，也就是平面3上聚焦。相位板P現在對S波有顯著影響，而大多數的D波卻不受影響。在正相襯中，相位板將所有穿過它的光線的幅度衰減約70-90%，而將相位提前90°，這樣，由於S波和D波的相位差達到180°，將引起相消干涉（180°的相移來自兩種效果的疊加，S波被相位板提前了90°，D波被相位物體延遲了90°）。如果沒有相位板，就不會有顯著的相消干涉，這樣就會導致對比度的降低。通過相襯照明的技術，不可見的相位變換現在可以轉變為可見的幅度變化。相消干涉在左圖中可以看到，藍色的波形和橙色的波形分別代表D波和S波，而他們的和（D+S）的幅度減小了。
圖像外觀
相襯顯微鏡現實的圖片的特徵是灰色的背景上面可以顯示出明暗的樣品結構。明暗的邊緣表示了樣品光學密度的變化，例如，細胞和水的邊界，這也通常表現為在暗的物體周圍會有明亮的光暈。
