全內反射螢光法:背景及簡介,原理,全內反射,全內反射中的螢光,全內反射螢光法的套用

全內反射螢光顯微技術是當今世界上最具前途的新型生物光學顯微技術之一,可以用來實現對單個螢光分子的直接探測。它利用全內反射產生的隱失波照明樣品, 使照明區域限定在樣品表面的一薄層範圍內, 因此具有其它光學成像技術無法比擬的高的信噪比和對比度。近年來, 已被生物物理學家們廣泛套用於單分子的螢光成像中。

基本介紹

中文名：全內反射螢光法
外文名：total internal reflection microscopy
專業：生物光學顯微技術

背景及簡介,原理,全內反射,全內反射中的螢光,全內反射螢光法的套用,全內反射螢光顯微鏡,展望,

背景及簡介

1590 年，Z .Janssen 和 H .Janseen 共同研製出世界上第一台光學顯微鏡。在隨後的幾百年間，顯微科學取得了迅猛的發展。人們逐漸地改進了成像質量，而且各種新的光學顯微鏡也應運而生。如偏振光顯微鏡、相差顯微鏡、倒置顯微鏡。但是傳統的光學顯微鏡由於受到光瞳遠場衍射效應的影響，存在分辨極限，瑞利將之歸納為 R ≥0 .61λ/nsin θ ，其中 λ為成像光波波長, nsinθ為物透鏡的數值孔徑, 即 N A 值。因此, 對可見光來說，光學顯微鏡空間分辨極限～ 250 nm 。從套用的角度,傳統的光學顯微術無法滿足更高的解析度要求。

生命科學中大量的事實表明細胞的動力學特徵是起源於單個蛋白質分子的聚合和相互作用,這就要求發展超高解析度的成像技術，從而在分子尺度上探測細胞生命活動的細節。在這種需求下, 20 世紀 30 年代電子顯微鏡發展起來。它導致了細胞研究的革命，使得生物學家得以從亞顯微水平上認識細胞世界。進入 80 年代，非光學類掃描探針顯微術，特別是原子力顯微鏡（AFM）的出現更是將成像的解析度推進到納米的精度。但是這些顯微術均在不同程度上存在系統結構複雜、成像檢測環境要求苛刻等困難，尤其是不能象光學顯微術那樣提供重要的光學信息(如偏振態、折射率、光譜等)和進行無損傷性生物活體探測，這些均嚴格限制了它們在高解析度細胞成像中的套用。與此同時, 新一代光學顯微技術發展起來。它們以其高的空間解析度和時間解析度、無損傷、以及對單分子活體探測的可行性,再次成為生物學家、物理學家和成像學家們研究的熱點。目前國際上公認的最有前途的單分子光學成像技術有全場相襯顯微術、共焦螢光顯微術，近場光學掃描顯微術和全內反射螢光顯微術。這些技術在分子生物學、分子化學、雷射醫學及納米材料等領域受到廣泛關注，並產生了深遠的影響。

Hirschfield於1965年完成了第一個全內反射螢光實驗。也正是他第一次嘗試用全內反射螢光法測液體中的單個分子的螢光，由此開始單分子螢光檢測技術的發展。

全內反射螢光顯微技術的儀器裝置由兩種類型：一為通常所見的稜鏡型顯微鏡，通過稜鏡將激發和發射光路分開，逝波區域的大小可以很容易地通過改變雷射光線寬度來調節，但是螢光成像效果並不是非常理想，迄今為止該類型的顯微鏡仍然套用很多；另一種為新近出現的物鏡型顯微鏡，該類型的物鏡是非常規的，具有更佳的空間解析度和更好的成像質量。

全內反射螢光法因其相對簡單、所需費用低廉、界面特效性好而引起人們的廣泛關注。至今，全內反射螢光法在理論上和套用上均已得到較大發展，出現了各種各樣的全內反射螢光法，如時間分辨全內反射螢光、多重內反射螢光、全內反射螢光相關譜、全內反射同步螢光法等等。全內反射螢光配合偏振技術和時間分辨技術在研究表面分子或近表面分子的取向、旋轉和螢光壽命方面已取得很好的效果。

原理

全內反射

全內反射是一種普遍存在的光學現象。考慮一束平面光波從玻璃表面進入到溶液中。入射光在玻璃表面上一部分發生反射，另一部分則透射進溶液。入射角和透射角之間滿足關係式

這裡 n₁ 是玻璃的折射率 , n₂ 是液體溶液的折射率。當入射角增大, 增大到臨界角 θ_c 時 ,這時的透射角為 90°;當入射角繼續增大到大於臨界角時,光不再透射進溶液, 也就是發生了全反射。

由上式可知 ,當 n ₂ <n ₁時 ,全反射就可能發生。從幾何光學的角度來看，當光發生全反射時，光會在玻璃界面上完全反射而不進入液體溶液中。實際上，由於波動效應，有一部分光的能量會穿過界面滲透到溶液中，平行於界面傳播。這部分光場就是所謂的隱失波。

全內反射中的螢光

根據上述全內反射原理，利用全內反射產生的隱失波激發樣品，使樣品表面數百納米厚的薄層內的螢光團受到激發，只有這個小範圍內的螢光分子將被激發，而在這個範圍以外的螢光分子則完全不受影響。所以全內反射螢光顯微術具有其它成像方法無法比擬的高的信噪比，細胞的光損傷和光漂白也很小。再用高靈敏度和高時間解析度的攝像機CCD來捕捉螢光並用計算機進行顯像，從而實現對生物樣品觀測。

全內反射螢光法的套用

基於全內反射螢光原理，可製成各式各樣的感測器。改變入射光的入射角度，倏逝波滲透深度隨之改變，因此可利用來考察螢光團隨界面距離的濃度變化。全內反射螢光可與螢光能量轉移結合以研究在表面上螢光團之間的距離。

在分離分析、生物、藥學及工業中經常要涉及兩種互不相溶的液體間形成的界面。液-液界面離子吸附在溶劑萃取和相關分離系統如液-膜分離、離子選擇性液膜電極和色譜中重要的基本過程。相對於液固界面來說，全內反射螢光法在液-液界面的套用較少，但已顯示出它獨特的魅力。Watarai等用全內反射螢光方法，研究了甲苯/水界面上羅丹明的旋轉動力學以及卟啉離子衍生物的離子結合吸附。Teramae等採用時間分辨全內反射螢光光譜研究庚烷-水界面上的8-胺基萘磺酸的微環境，發現在界面附近的螢光團以兩種結構形式存在，且分布位置有所不同。利用時間分辨全內反射螢光測定法可研究油水界面的極性。

全內反射螢光法已成為螢光光譜學在生物化學套用中的重要工具。表面分子的分布和動力學是眾多生物學的核心問題，例如：激素、神經遞質和抗原對細胞的結合和刺激，血漿蛋白在異物表面沉積引起凝血，細胞表面吸附擴散等。在這些例子中，功能性分子一般以表面結合態和非結合態共存，若用常規螢光方法，則表面結合分子的螢光就可能被非結合分子所掩蓋。而採用全內反射方式，則允許選擇地激發那些表面層的螢光分子。全內反射螢光法在生物中的套用主要體現在以下幾個方面：蛋白質吸附平衡、表面分子濃度梯度變化、表面分子的旋轉、螢光壽命及反應速率的測量、選擇性觀測細胞/底物接觸區等。其中蛋白質界面吸附平衡是全內反射螢光法的重點套用領域。可通過研究蛋白質在人工表面的吸附平衡來了解各種生物材料的表面性質。Edmiston等利用全內反射螢光各向異性和吸收二色性結合研究細胞膜中的分子旋轉分布。Chan等將全內反射螢光用於液-固界面的DNA寡核苷酸的吸附和表面擴散研究。利用一種pH敏感螢光團產生的全內反射螢光，可觀測吸附水解酶的自發重構化。新近，全內反射螢光技術已用於實時監測核酸相互作用、考察吸附在石英上的水解酶分子的重定向機制，以及觀察細胞膜100nm範圍內的實時生命活動等。

全內反射螢光顯微鏡

全內反射螢光顯微鏡是全內反射螢光法的直接套用，其具有兩種類型，稜鏡型和物鏡型。稜鏡型成像系統的隱失場是通過入射光經稜鏡發生全反射產生的，而物鏡型的是通過入射光經物鏡本身全反射產生。隱失波激發生物樣品的螢光分子，螢光分子所發射的螢光經過物鏡成像到照相機或CCD上實現對生物樣品的記錄。

兩種形式的顯微鏡各有優缺點，對於稜鏡型而言，實現起來相對簡單，同時它的缺點也很明顯：由於要達到較高的光學解析度，要求接收螢光的物鏡工作距離較短，這樣留給生物樣品和物鏡之間的空間較小，所以在此儀器上安裝一些諸如原子力顯微鏡、近場光學顯微鏡等其他探測儀器非常困難。並且由於螢光的接收必須經過被觀察樣品的上部，這樣螢光必然會有散射、衰減及其它光信號的干擾，使觀察的效果有所下降。而對物鏡式而言，則可以克服以上缺點。物鏡式顯微鏡的物鏡既作為收集樣品螢光信號的接受器，同時又作為發生全反射的光學器件。雷射聚焦到物鏡後焦面並經過物鏡邊緣入射，物鏡出射光為平行光並斜入射至蓋玻片上，調節雷射入射位置和角度，即可達到全內反射要求，從而實現隱失波照明。隱失波所激發的螢光仍舊經過物鏡接收，通過雙色鏡濾掉除螢光以外的其它波長的光，成像在物鏡後方的照相機或CCD上，實現對生物樣品的螢光記錄。由於樣品上方空間完全空出，並且所接受的螢光沒有被樣品干擾，所以目前大多數生物學家採用物鏡式全內反射螢光顯微鏡。

展望

不論是對物理成像學家還是對細胞生物學家而言 ,全內反射螢光顯微術均是一項新的技術。它的未來發展將向著兩個前沿方向發展：技術上的進一步創新和在新的細胞生命科學領域中的套用。這意味著在一方面全內反射螢光顯微術將繼續和其它的顯微成像技術 , 如螢光相關光譜技術(FCS), 螢光壽命成像技術(FLIM)以及原子力顯微術(AFM)相結合;另一方面, 繼續尋求成像原理上的突破 ,這也正是目前有待積極探索的課題。其中雙色和多色全內反射螢光激發在國際上剛嶄露頭角。在生物學的套用上，由於全內反射螢光成像的獨特優勢 ,它將成為細胞-基底接觸區域內的豐富的細胞生命活動 ,如細胞膜內蛋白質的動力學過程 ,基底附近的細胞骨架，細胞運動等最強有力的探測方法。我們有理由相信隨著光電探測設備探測效率和探測速度的提高以及單分子染色技術的發展, 全內反射螢光成像技術將越來越生動的把細胞內的生物世界展現在我們面前。

全內反射螢光法