隨機光學重建顯微法

隨機光學重建顯微法(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)是一種將螢光光譜和顯微分析技術套用於單個分子之上的嶄新的物理手段，其是一種比傳統光學顯微鏡高10倍以上解析度的新型顯微技術。

基本介紹

• 中文名：隨機光學重建顯微法
• 外文名：stochastic optical reconstruction microscopy，STORM
• 專業：物理光學技術
• 發明人：莊小威

背景

由於具有高特異性，螢光顯微鏡被廣泛用於分子和細胞生物學的非侵入性、時間分辨成像。儘管有這些優勢，由於光學衍射造成的解析度限制，傳統的螢光顯微鏡已經不適於超微結構成像。有幾種方法已經開始打破這些衍射局限，包括近場掃描光學顯微鏡、多光子螢光顯微鏡、STED和SSIM。NSOM、STED和SSIM的側向解析度達到幾十nm，但是也達到了各自的解析度極限。NSOM很難在非侵入模式下操作，焦深小。多光子顯微鏡、STED、SSIM都屬於非線性光學效果，需要高強度的脈衝雷射，會導致樣品受損。要開發超高解析度成像技術，必須利用好螢光顯微鏡的優勢。
在2006年的Nature上，莊小薇與其它同事發現了一種能夠數百次反覆在各種顏色的光照下使用且可在螢光態和暗態轉化的發光分子團，從而得到了一種比傳統光學顯微鏡高10倍以上解析度的顯微技術，並將這種技術命名為隨機光學重建顯微法(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)。

STORM方法（stochastic optical reconstruction microscopy），是用很弱的光激發螢光分子，使細胞內的一小部分螢光分子發光，而不是全部。這樣由於發光的點分布比較分散，重疊比較少，因此每個光暈可以近似為一個螢光分子。在一次激發中，可以確定一部分光暈的中心，在下一次激發中，可以確定另外一部分光暈的中心，把這許多次激發的結果疊加，就是完整而清晰的圖像。

發明人簡介

莊小威，1972年出生於江蘇省如皋縣，1987年畢業於蘇州中學的科大少年班預備班，1991年，獲得中國科學技術大學物理學學士，1997年，她獲美國加州大學伯克利分校物理學博士，1997年至2001年於史丹福大學攻讀博士後。作為年僅40歲的女性，莊小威在科學殿堂里取得的成就令人矚目，她34歲成為哈佛的化學和物理雙學科正教授，是哈佛物理系和化學系少有的雙科教授，她在哈佛大學建立了自己的實驗室，還是霍華德·休斯醫學研究所的研究員，2012年5月1日，她當選為美國國家科學院院士。

STORM技術原理

利用可光轉化螢光分子的開關，對其準確定位，然後重建螢光圖像。STROM成像過程包含一系列圖像循環。每個循環中，只打開視野下一部分螢光基團，這樣每個活躍的螢光集團都被分辨，它們的圖像與其他分子分開，不重疊。這樣確定了基團的準確位置，多次重複這個過程，每次隨機打開螢光基團的不同亞基，得到圖像，確定每個亞基的位置後，把以上圖像重建成清晰的整個圖像。以下的例子中，研究者們獲得20nm左右的解析度。

圖1 STORM原理圖

STORM成像順序

假定一個標記紅色螢光基團的六聚體，這個螢光基團在紅色和綠色脈衝雷射下可轉換螢光和暗態。所有的螢光基團都可被強紅脈衝雷射轉化成暗態。在每個成像循環，綠色雷射脈衝只打開螢光基團的一部分，這樣可以分辨出活躍的螢光基團。接下來，紅光照明下，關閉前這些分子一直發出螢光，這樣可以準確確定他們的位置。多個成像循環後重建整個圖像
永久淬滅前，連在DNA上的Cy5能被打開關閉數百次，紅色雷射(633 nm, 30W/cm2)被用於激發Cy5和轉化Cy5到暗態。綠色雷射(532 nm, 1 W/cm2)被用於轉換Cy5到螢光狀態。紅綠線的轉換顯示不同的雷射激發模式。

配置

包括簡單全內反射顯微鏡、低壓連續波長雷射器和光轉換染料，如花青素Cy3和Cy5。

STORM技術的優點

1、突破衍射極限：STORM圖像顯示了兩簇被檢開關位置，可以看出雙開關很好的分開了。兩簇中心的距離是41nm，與理論上的量值符合。研究者還用4個開關標記過更長的DNA樣品，STORM圖像結果揭示出四簇開關的位置和開關間的距離。這些結果顯示STORM可以在突破衍射解析度限制的情況下為生物樣品成像。
2、可控模式下開啟、關閉開關，進而定位大批開關的位置，這樣可用於生物成像技術。為展示這方面的能力，他們準備了外包RecA蛋白的DNA環狀質粒，用開關式二抗進行間接免疫螢光成像。

技術缺陷

整個STORM技術的圖象處理過程需要幾分鐘的時間，太慢，同時染料不夠豐富。

最新進展

2007年Science的一篇研究報告：利用一組可轉換螢光探針獲得了多色隨機光學重建顯微法（multicolor stochastic optical reconstruction microscopy）。利用這種方法，研究人員以20-30納米級別的解析度演示了DNA模式樣品和哺乳動物細胞的多色成像，這種納米級的技術不僅將在分子相互作用的直接可視成像方面大放異彩，也將幫助其它細胞活動或分子活動的觀測。
2008年Science的一篇研究報告：利用3D STORM在納米級確定單個螢光基團的軸向和側向位置，側向解析度達到20-30nm，軸向解析度達到50-60nm，這樣可以分辨納米級的3D結構。