盒式誘變

所謂盒式誘變(cassette mutagenesis)，就是利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即所謂的寡核苷酸盒(oligonucleotide cassette)，取代野生型基因中的相應序列。盒式誘變是一種定點突變技術，將靶基因的一段DNA刪掉，並用人工化學合成所具有的突變核苷酸的雙鏈寡核苷酸片段取代。包括簡單的盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。

基本介紹

• 中文名：盒式誘變
• 外文名：cassette mutagenesis
• 原料：人工合成有突變功能的寡核苷酸
• 特點：一種定點突變技術
• 反應：核苷酸取代
• 舉例：簡單的盒式取代誘變等

簡介

盒式誘變(cassette mutagenesis)是一種定點誘變技術，其方法是利用一段人工合成的具有突變序列的雙鏈寡核苷酸片段，取代野生型基因中相應序列。這種誘變的雙鏈寡核苷酸片段是由兩條人工合成的寡核苷酸鏈組成的，當它們退火時，會按照設計要求產生出克隆需要的粘性末端。這些合成的寡核苷酸片段就好像不同的盒式錄音磁帶，可隨時插入到已製備好的載體分子(“錄音機”)上，便可以獲得數量眾多的突變體，故稱為盒式誘變。該方法的優點是簡單易行，突變效率高。

盒式誘變包括簡單的盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。簡單的盒式取代誘變是通過限制性內切酶切除特定的雙鏈DNA片段，再與含有突變的單一序列雙鏈寡核苷酸連線，得到取代突變，是一種定點誘變。若用於取代的是含有隨機突變的混合雙鏈寡核苷酸，則可在限定區域內引入大量的隨機突變。

基因定點誘變

對於任何一種遺傳學研究，尤其是有關基因的結構與功能的分析，突變都是最基本的手段。經典的方法是，套用能夠修飾DNA分子的化學誘變劑或物理誘變劑處理生物體。此類誘變方法雖然已得到了廣泛的套用，獲得了大量的突變體，但亦存在著諸多的不便之處。

第一，經受誘變劑處理的生物體，它的任何基因都有可能發生突變，而目的基因的突變頻率又可能相當低，因此給突變體的篩選工作造成了很大的麻煩。

第二，即便分離到了具有期望表型的突變體，人們也無法保證所出現的突變確實就是發生在目的基因上。

第三，在基因克隆和核苷酸測序技術發展之前，我們既無法知道究竟是在基因的什麼部位發生了突變，也無法弄清這種突變到底是因單鹼基取代抑或是由於DNA片段的插入和缺失所致。

隨著分子生物學方法的進步，特別是基因克隆技術的套用，分離並研究單基因的結構與功能已成為一種常規的工作。與此相適應，基因的誘變技術也有了極大的發展。人們不僅能夠對多細胞或是有機體作誘變處理，並從成千上萬的突變群體中篩選出期望的突變體，而且還能夠取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一個特定的鹼基，這種體外特異性改變某個鹼基的技術，叫做定點誘變(site—directed mutagenesis)。由於它具有簡單易行、重複性高等優點，現已發展成為基因操作的一種基本技術。這種技術的重要性除了能夠用於研究基因的結構與功能的關係之外，還能夠通過使非常特異的胺基酸發生改變來獲得突變體蛋白質，即所渭的蛋白質工程。而此類蛋白質突變體的產生則有助於開展催化機理、底物特異性和穩定性等方面的研究。已發展的定點誘變方法主要有盒式誘變、寡核苷酸引物誘變及PCR誘變等。

盒式誘變法

基因工程技術不但可使基因產生特異性位點突變，也可以產生區域性的突變。常用的方法如盒式突變法，又稱片段取代法。這一方法的要點是利用目標基因中所具有的適當的限制性內切酶位點，用人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段(這種合成的片段被稱為盒)，來置換或取代目標基因中的相應序列。這種用於突變的盒可以是任意大小、任何序列，通常盒的大小與所取代片段的大小相同。利用盒式突變可以產生各種特異性的突變或突變家族，在這些突變體中各種不同的序列被集中在目標基因的一個特定區域，從而為研究蛋白質特定結構區域或特定結構域的結構和功能提供了一個切實可行的方法。

進行盒式誘變時，在目標基因序列中要有適當的限制性，內切酶識別位點，使得用以取代天然DNA序列的盒式突變序列可以有效地插入到目標基因中。然而對於一個天然蛋白質基因而言，其所含的可供利用的限制性內切酶位點相當少，影響盒式突變的操作。為了在目標基因的特定位置產生合適的酶切點，可以利用遺傳密碼的簡併性，在不改變胺基酸序列的前提下，通過改變某些核苷酸的序列，產生合適的限制性內切酶位點。

PCR方法和前述定點誘變方法都可引入。要求引入的酶切位點對目標基因是單一的，而且對目的基因沒有影響。對於化學合成的基因或基因片段而言，可以利用密碼子簡併原則，在合成基因的設計階段，就設計好合適的限制性內切酶識別位點，便於盒式突變的操作。Wells等用此法成功地在枯草桿菌蛋白酶胺基酸序列第222位上替換了10種胺基酸的殘基。盒式誘變原理圖如圖1。

圖1 盒式誘變原理圖

寡核苷酸引物誘變

寡核苷酸引物誘變是由加拿大生物化學家Michael Smith發明的一種基因定點誘變方法。其基本原理是：合成一段寡聚脫氧核糖核苷酸作為引物，其中含有需要改變的鹼基，使其與帶有目的基因的單鏈DNA配對，合成的引物除短的錯配區外，與目的基因完全互補，然後用DNA聚合酶延伸引物，完成單鏈DNA的複製。由此產生的雙鏈DNA分子，一條鏈為野生型親代鏈，另一條鏈為突變型子代鏈，將獲得的雙鏈DNA分子導入宿主細胞，並篩選出突變體，其中基因已被定向修改。

PCR技術

PCR技術為基因的體外改造提供了簡便快速的方法。通過設計特定的引物和PCR技術，可以在體外對目的基因進行點突變、缺失、嵌合等改造。

定點誘變與盒式誘變的比較

構建一個位點導向的文庫涉及使用含有一個或多個簡併密碼子的合成DNA片段替代一個基因片段。這可以通過雙鏈盒式誘變或單鏈寡核苷酸定向誘變來實現。我們相對傾向於寡核苷酸定向誘變，因為不同於盒式誘變，它不需要在目的區域附近有獨特的限制性酶切位點，並且構建一個文庫只需要一個寡核苷酸片段。因此，這個方法相當簡單且健全。