定位突變

定位突變是在已知蛋白質結構與功能的基礎上，在已知DNA序列中取代、插人或刪除特定的核苷酸，從而產生具有新性狀的突變蛋白質(酶)分子的一種蛋白質工程技術，該技術在生物和醫學領域中的套用非常廣泛。定位突變技術具有突變率高、簡單易行、重複性好的特點。定位突變技術作為一種研究手段，也廣泛套用於研究蛋白質的結構與功能的關係，從而闡明基因的調控機理、疾病的病因和機理等。

基本介紹

• 中文名：定位突變
• 外文名：site-directed mutagenesis
• 對象：DNA序列
• 方法：取代、插人或刪除特定的核苷酸
• 目的：具有新性狀的突變蛋白質
• 類型：蛋白質工程

簡介

基於天然蛋白質結構的蛋白質分子“小改”是指對已知結構的蛋白質進行少數幾個殘基的修飾、替換或刪除等，這是目前蛋白質工程中最廣泛使用的方法，主要可分為蛋白質修飾和基因定位突變兩類。基因定位突變是指從基因水平上進行蛋白質分子的改造，即採用定位誘變的方法，對編碼蛋白質的基因進行核苷酸密碼子的插入、刪除、置換和改組，然後對突變後的基因進行蛋白表達並分析所表達蛋白質的功能活性，其結果為蛋白質分子改造提供新的設計方案。

定位突變的設計目標及解決方法

定位突變常見的設計目標是提高蛋白質的熱、酸穩定性、增加活性、降低副作用、提高專一性，以及通過蛋白質工程手段進行結構一功能關係的研究等。Hartley等於1986年完成了一個我們所要的設計目標及解決的辦法，至今仍有重要的參考價值。其中蛋白質的穩定性是蛋白質正常發揮生物活性的重要前提，因此改善蛋白質的穩定性成為蛋白質設計和改造的重要目標之一。

定位突變的種類

要進行基因定位突變，改變DNA核苷酸序列，方法有很多種，如基因的化學合成、基因直接修飾法、盒式突變技術等。根據基因突變的方式，還可以分為以下三類：插入一個或多個胺基酸殘基；刪除一個或多個胺基酸殘基；替換或取代一個或多個胺基酸殘基。要達到基因定位突變的目的，多採用體外重組DNA技術或PCR方法。

定點突變

蛋白質中的胺基酸是由基因中的三聯密碼子決定的，只要改變其中的一個或兩個鹼基就可以改變胺基酸的種類，從而產生新的蛋白質。通常是改變功能區域某個位置的胺基酸，以研究蛋白質的結構、穩定性或催化特性。點突變的工作是當前蛋白質工程研究的主體，到目前為止，已經對枯草桿菌蛋白酶、T4溶菌酶、二氫葉酸還原酶、胰蛋白酶以及核糖核酸酶等許多種類的蛋白質進行改造試驗。例如，將組織型纖維蛋白酶原活化劑(tissue-type plasminogen activator，t-PA)的Asn117替換為Glu117，從而除去一個原有的糖基化位點；由於該處原有的糖鏈能促進t-PA從血漿清除，因此點突變後能夠降低t-PA的血漿清除率，延長血漿半衰期。

盒式突變

1985年Wells提出的一種基因修飾技術一盒式突變，一次可以在一個位點上產生20種不同胺基酸的突變體，可以對蛋白質分子中重要胺基酸進行“飽和性”分析。利用定位突變在擬改造的胺基酸密碼兩側添加兩個原載體和基因上沒有的內切酶切點，用該內切酶消化基因，再用合成的發生不同變化的雙鏈DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。

定位突變的程式

基因定位突變的蛋白質分子設計程式遵循設計原理中的程式，但基因定位突變又有其特殊性，其具體的程式如下。

1、建立所研究蛋白質的結構模型

建立蛋白質三維結構模型，對確立突變位點或區域以及預測突變後的蛋白質的結構與功能是至關重要的。可以通過X射線晶體學、二維核磁共振等測定結構，也可以根據類似物的結構或其他結構預測方法建立起結構模型。

2、找出對所要求的性質有重要影響的位置

在改造中如何恰當地選擇突變殘基是一個關鍵問題，這不僅需要分析殘基的性質，同時還需要藉助於已有的三維結構或分子模型。例如，通過引入二硫鍵期望提高蛋白質的穩定性，面臨的一個問題是怎樣選擇合適的突變位點。蛋白質中的二硫鍵具有一定的結構特徵，隨機選擇突變位點引入二硫鍵會給整個分子帶來不利的張力，不但不會提高蛋白質的穩定性，反而會降低蛋白質的穩定性。選擇突變殘基，最重要的信息來自結構特徵。因此，如果蛋白質的立體結構是未知的，則突變功能殘基的研究帶有不確定性，不能很好區別蛋白質構象扭曲變化的影響與原有功能殘基突變的影響。①為解決這個問題，人們嘗試了幾何方法、分子力學方法、分子動力學等多種方法，並已經編制了一些實用的程式，可以在試驗前篩選可能的以及較好的突變位點。相類似的，對於其他類型的突變也可以進行預測。目前已有許多方法和程式可以在已知天然蛋白質結構的基礎上預測突變體的結構和性質，這些設計工作為人們的實驗工作提供了信息和指導；②可以根據序列同源性或原先的生物化學實驗證據來選擇突變殘基，也可以通過隨機或合理篩選技術鑑定重要的功能區域，以便進一步重點分析蛋白質功能殘基；③可以從天然蛋白質的三維結構出發，利用計算機模擬技術確定突變位點及替換的胺基酸。同一家族中的蛋白質的序列對比、分析往往是一種有效的途徑。需要認真考慮此種性質受哪些因素的影響，然後逐一對各因素進行分析找出重要位點，這是分子設計的關鍵。

在具體選擇突變殘基時，一方面要滿足蛋白質可能具有所要求的性質，另一方面又儘量維持原有結構，使其不做大的變動。儘量在同源結構中此位點已有的胺基酸殘基表中進行選擇，同時考慮殘基的體積、疏水性等性質的變化所帶來的影響。還應確定序列中對摺疊敏感的區域，確定對功能重要的位置，考慮剩餘位置對所希望改變的影響，考慮它們對結構特徵的影響，以及它們對蛋白質功能的影響。

3、預測突變體的結構

根據所選定的胺基酸殘基位點及突變後的胺基酸種類，利用相關軟體進行突變體的結構預測，將預測的結構與原始的蛋白質結構比較，利用蛋白質結構一功能或結構一穩定性相關知識及理論計算預測新蛋白質可能具有的性質，同時利用能量最佳化及蛋白質動力學方法預測修飾後的蛋白質結構，以修正所選擇的胺基酸位點和突變後的胺基酸種類。

4、構建突變體。獲得突變體蛋白

依據所設計好的突變，利用化學合成或PCR等方法構建突變體。進行基因測序驗證突變體後，將突變體進行表達，純化蛋白質，獲得所設計的新蛋白質。

5、突變體蛋白質的檢驗

測定新蛋白質的序列、三維結構、穩定性、催化活性等，並與對應的天然蛋白質進行比較，檢驗突變設計的效果，同時進一步修正設計方案。要得到具有預期結構與功能的蛋白質是不容易的，可能需要經過幾輪的循環才行。

定位突變殘基的鑑定

對於新蛋白質的功能分析，最重要的是對數據的解釋。在數據分析過程中，如何區別由功能殘基替換引起的效應及蛋白質構象變化引起的效應是所有突變分析中共同存在的困難。對於三維結構未知的蛋白質這個問題尤為嚴重，因為我們無法確定殘基的立體位置與周圍結構環境，殘基對溶劑的暴露程度以及同附近殘基的相互作用。下面介紹幾種新蛋白質突變殘基的鑑定方法。

1、根據結構信息確定殘基的突變

這種方法是鑑定新蛋白質分子中突變殘基最有效最直接的方法。可利用X射線或NMR進行新蛋白質分子的三維結構測定，這種方法可以直接提供突變蛋白的高解析度結構及評估結構整體性。根據新測定的三維結構與突變前的三維結構進行分析比較。重點分析突變位點的胺基酸殘基在三維結構中的位置，以及與其他基團之間形成的氫鍵、離子對或疏水相互作用等，以證實該位點殘基在蛋白質分子的結構與功能中的作用。Alan Fersht和GregWinter等測定了酪氨醯一tRNA合成酶突變體的三維結構，通過分析該酶的Cys35被結構相似的絲氨酸所取代後的結構，發現Cys35可能與酪氨醯腺苷酸中間體中的3'羥基形成氫鍵，突變效應降低了酶的活性，證實了Cys35在結合腺苷酸部分的作用。蛋白質三維結構的測定，可用於鑑定最暴露於蛋白質表面的殘基，還可用於估計專一性突變對結構改變的可能性。這種方法需要較大量的純的突變蛋白，並要花較長時間，因此這種技術不能用於常規的大量突變體的分析。

2、突變方法鑑定突變功能殘基

定點突變引起的結構變化可以通過在蛋白質中引進另外一種突變來檢測。這種多重突變中單一突變是有加和性的，偏離這個規則說明殘基問的相互作用引起構象的變化。隨機突變、刪除分析以及連線片段掃描突變等實驗方法可用於鑑定功能殘基。隨機突變技術分析蛋白質功能的優勢在於通過簡單的方法就可產生突變體，但必須進行大數目的突變產生大量可解釋的數據，因為隨機突變對於突變沒有加以控制。刪除分析及連線片段掃描突變涉及在整個基因位置刪除或插入少量的核苷酸，此類突變可以很容易通過重組DNA技術構建。這兩種技術已經非常成功地用於確定在基因調控區域的DNA序列單元，這些方法也可用於蛋白質的分析。

3、利用蛋白質同源性鑑定突變功能殘基

將感興趣的目的蛋白質序列與同源蛋白質進行序列比較，可以發現一些高度保守的殘基，這些殘基與同源蛋白的共同功能以及維持結構有關，因此通常將它們作為突變及功能進化的候選殘基。每個殘基所起作用的信息能夠通過與不同種同源蛋白的序列比較或一類具有相應活性的蛋白質的序列比較而獲得。另外同源蛋白質保守的殘基是保持那類蛋白質共同功能或者是維持共同結構的關鍵因素，因此在一類蛋白質內非保守殘基的變化可能涉及每個蛋白質獨特的功能，如底物或結合專一性。因此非保守殘基是分析的靶位點，特別是對於專一性研究。

此外，還可以利用蛋白質的溶解性、熱力學分析及NMR譜等方法探測突變蛋白質結構的整體性質，以鑑定突變殘基。在某些情況下，突變可能破壞蛋白質的球形整體結構，引起蛋白質失活、不溶性以及在細胞中降解，因此溶解度與突變蛋白質的穩定表達可以作為結構整體性的一個標誌。熱力學分析可以用於測量突變蛋白質的熱穩定性及化學變化自由能，並可作為構象整體性的檢測。除此以外，圓二色譜法可以快速分析突變體結構，但該方法存在很明顯的不足，即需要較大量的純突變蛋白，而且只提供二級結構及三級結構的相對變化。如果突變後的蛋白質仍保持蛋白質的整體構象，我們可以利用單克隆抗體的結合能力探測突變蛋白的構象變化，因為只有在單克隆抗體的抗原決定簇與突變位點重疊時，這種結合才會受到影響。然而，這種方法也只能檢測蛋白質表面的構象變化，對於埋藏在口袋中的殘基(如酶的活性位點)的結構微小變化是無法檢測的。

利用突變的方法研究蛋白質的功能很難區別突變效應和結構微小變化之間的關係，因此帶有一定的不確定性。比較好的解決辦法是儘可能多地了解蛋白質的結構、進化保守以及生物化學信息，以減少突變過程對結構產生的影響。最好的突變策略依賴於所涉及的蛋白質、生物體系以及已掌握的信息。