病毒測定培養

病毒測定培養是通過顆粒計數法、間接計數法或感染效價法測定病毒數量，用人工方法培養細胞後再接種病毒，使病毒在活細胞內大量增殖。病毒人工培養方法包括動物接種、雞胚培養和細胞培養（器官培養、組織培養和細胞培養），其中常用的為細胞培養法。

基本介紹

• 中文名：病毒測定培養
• 外文名：Virus culture
• 套用學科：環境微生物
• 適用領域範圍：環境生態
• 測定方法：顆粒計數法、間接計數法等
• 培養方法：動物病毒培養、噬菌體分離培養

病毒的測定

樣品中的病毒數量可用顆粒計數法、間接計數法或感染效價法進行測定。

（1）病毒顆粒計數法

病毒顆粒計數法可直接用電子顯微鏡計數。它通常被用於已知形態病毒的濃縮樣品的計數。其測定方法是將病毒樣品與已知濃度的乳膠小顆粒均勻混合，然後將混合液均勻噴灑在已包被的樣品方格網上，分別計乳膠顆粒和病毒顆粒數目。病毒的濃度可由樣品中兩種顆粒的比例和乳膠顆粒濃度計算得出。

（2）間接計數法

用血細胞凝集試驗計數是分別將紅細胞與一系列10倍稀釋的病毒樣品混合，再觀察結果。以能引起血細胞凝集的最高稀釋倍數（或稀釋倍數的倒數）為病毒的效價。

（3）病毒感染效價測定法

病毒（噬菌體）感染效價測定法與以下的病毒培養方法基本相同。

病毒的培養特徵

（1）病毒在液體培養基中的培養特徵

將噬菌體的敏感細菌接種在液體培養基中，經培養後敏感細菌均勻分布在培養基中而使培養基渾濁。然後接種噬菌體，敏感細菌被噬菌體感染後發生菌體裂解，原來渾濁的細菌懸液變成透明的裂解溶液。

（2）病毒在固體培養基上的培養特徵

將噬菌體的敏感細菌接種在瓊脂固體培養基上生長形成許多個菌落，當接種稀釋適度的噬菌體懸液後引起點性感染，在感染點上進行反覆的感染過程，宿主細菌菌落就一個個地被裂解成一個個空斑，這些空斑就叫噬菌斑。

病毒的培養基

病毒是專性寄生在活的敏感宿主細胞內才能生長繁殖的超微生物。因此，病毒的培養基要求苛刻，專一性強。其敏感細胞要具備如下條件：① 必須是活的敏感動物或是活的敏感動物組織細胞；② 能提供病毒附著的受體；③ 敏感細胞內沒有破壞特異性病毒的限制性核酸內切酶，病毒進入細胞可生長繁殖。

不同種類的病毒其培養基是不同的。

脊椎動物病毒的培養基有：① 人胚組織細胞（如人胚腎、肌肉、皮膚、肝、肺、腸等器官的細胞）；② 人組織細胞（如扁桃體、胎盤、羊膜、絨毛膜等）；③ 人腫瘤細胞（如Hela細胞、Hep-2細胞、上皮癌細胞等）；④ 動物組織細胞（如猴腎和心臟、兔腎、豬腎細胞等）；⑤ 雞、鴨胚細胞（如肌皮和全胚細胞）；⑥ 敏感動物（如猴、兔、羊、馬、小白鼠、豚鼠等），腦炎病毒最宜選用幼齡小白鼠作敏感動物。

植物病毒的培養基：與植物病毒相應的敏感植株和敏感的植物組織。

噬菌體的培養基：與噬菌體相應的敏感細菌，如大腸桿菌噬菌體用大腸桿菌培養。

病毒的培養

動物病毒的培養

動物病毒的培養方法有動物接種、雞胚接種和組織培養技術。現在動物接種很少用，僅柯薩奇A病毒組（腸病毒）的分離仍用此法。雞胚常用於分離流感病毒，雞胚的羊膜腔和尿囊腔用作常規注射部位，如痘病毒被注射入絨毛尿囊膜上，以呈現在尿囊膜表面的痘斑或痘皰進行計數。現在，組織培養技術已廣泛套用，下面略作介紹。

（1）動物病毒的空斑試驗

① 單層細胞的製備和培養：用無菌小刀將動物組織切成0.5～1 mm的小塊，用平衡鹽溶液（Hank’s或Earle’s）洗滌數次，加體積分數5%胰酶消化10～15 min（有的消化時間長至30 min，甚至十幾小時），將細胞間的“間質蛋白”水解，使細胞分散，將胰酶沖洗掉，吹散細胞並計數。加入含牛血清的生長液，分裝，保持37 ℃溫度，培養2～3 d即長成單層細胞，以備培養病毒用。還可經傳代後再培養病毒。

② 病毒樣品的採集與製備：病毒存在於動、植物病灶的組織、體液、分泌物、糞便、下水污泥、活性污泥、污水、河水、湖水、海水等處。病毒樣品有三種狀態，它們的採集和製備有所不同。固體病毒樣品採得後，加液體培養基製成懸液，以10000 r/min離心10 min，去雜質，取其上清液備用。液體病毒樣品則直接以10000 r/min離心10 min，去雜質，取其上清液備用。空氣病毒樣品採用真空泵抽取至長有宿主菌的平板上，或是將長有宿主菌的平板打開蓋，在空氣中暴露30～60 min以收集。若樣品中病毒濃度大則要適當稀釋，若樣品中的病毒濃度小則要濃縮。

③ 動物病毒的接種與觀察：將病毒懸液置於單層細胞的表面，經適當時間孵育，使病毒最大限度地吸附在宿主細胞上。再將軟瓊脂或羧甲基纖維素注入鋪在單層細胞表面，再經一定時間培養，結果在單層細胞上呈現出空斑。以出現的空斑數判斷病毒數。

所謂空斑是指原代或傳代單層細胞被病毒感染後，一個個細胞被病毒蝕空成空斑（亦稱蝕斑）。一個空斑表示一個病毒。所以，通過病毒空斑單位的計數可知單位體積中含有的病毒數。

（2）系列稀釋終點

首先將病毒稀釋成一系列稀釋懸液，將病毒系列稀釋液接種到含宿主細胞的培養管中（三管至五管法），或接種到敏感的動物體內，經適當的溫度培養後，藉助顯微鏡觀察細胞形態的改變（細胞病理效應CPE），並觀察培養管的變化，由渾濁轉變至清。還可觀察感染動物出現死亡、癱瘓或其他病變。記下每個系列稀釋液陽性樣品的百分率和病毒的稀釋度，作圖可得到病毒的滴度或終點。

所渭病毒的滴度是：指能產生培養管中的50%CPE（細胞病理效應）的最高病毒稀釋度（即最少的病毒量），稱為TCLD₅₀。（組織培養感染劑量）。若是敏感動物則用ID₅₀（使50%的敏感動物發生變化的感染劑量），或LD₅₀。（引起50%敏感動物死亡的致死劑量）表示病毒的滴度。

噬菌體的分離培養

用雙層瓊脂法培養，在實驗的前一天在滅菌的培養皿內倒入10 mL適合某種宿主菌生長的瓊脂培養基，待凝固成平板後置於一定溫度的恆溫箱內烘乾平板上的水分，取2～3滴宿主菌（每mL含10個細菌）於軟瓊脂培養基（融化並冷至45 ℃）中，再加入0.1 mL噬菌體樣品，搖動混勻後全部倒入，使鋪滿整個瓊脂平板上，凝固後，於一定溫度的恆溫箱中倒置培養一定時間後，取出計數。