病毒包裝

病毒包裝，外文名Virus packaging，是一種基因診斷、基因治療技術。

基本介紹

• 中文名：病毒包裝
• 外文名：Virus packaging
• 隨著：分子生物學的理論及技術方法
• 構建：各種載體、克隆及分析目標基因
• 誕生了：基因診斷、基因治療技術

套用領域

隨著分子生物學的理論及技術方法（特別是重組DNA技術）的迅速發展，人們可以在實驗室構建各種載體、克隆及分析目標基因，使疾病深入至分子水平研究，於是誕生了基因診斷、基因治療技術。

基因治療從基因角度理解是對缺陷的基因進行修復增補，或將正常有功能的基因置換的方法。 從治療角度理解是一種基於導入遺傳物質以改變患者細胞的基因表達從而達到治療或預防疾病的目標的新措施。

當代基因治療研究的熱門方法是將外源基因DNA或RNA片段導入靶細胞或組織，研究靶基因的上調或抑制情況。例如，有些異常基因（癌基因、病毒基因），可通過反義核酸技術引入外源片段將其抑制；有些基因本身有治療作用，體外合成該基因導入體內使其表達豐度提高。

故選擇合適高效的基因導入介質系統尤為關鍵。而病毒載體已成為當前基因治療載體研究的熱點，其優勢在於：

1、病毒包裝技術經歷了多年的研究，已趨於成熟，可用於產業化大量生產。

2、病毒基因組的結構簡單、分子背景比較清楚，穩定易於改造、易於製備。

3、病毒的宿主範圍廣，且具有高效的靶向特異性。

4、在目的基因表達方面相對於脂質體介導的效果更明顯、長時、穩定。

5、通過載體改造的方式形成了複製缺陷型結構，安全性高。

幾種病毒載體的區別：

	腺病毒表達系統	慢病毒表達系統	逆轉錄病毒
病毒基因組成	雙鏈DNA	單鏈RNA	單鏈RNA
載導容量	< 8 kb	< 5 kb	< 6 kb
基因整合功能	無。病毒基因組游離於宿主基因組外，瞬時表達外源基因	有。病毒基因組整合於宿主基因組，長時間、穩定表達外源基因	有。
表達豐度	高	中	中
表達時間	快(1-2天)	慢（2-4天）	快（1-2天）
感染細胞類型	分裂和不分裂細胞	分裂和不分裂細胞。適用於難轉染細胞	感染分裂細胞，但在幹細胞中表達效率低
滴度TU/ml	10^12	10^9	10^9
四環素誘導系統	不可以	TET-ON , TET-OFF	不可以
毒性作用	細胞毒性	遺傳毒性	遺傳毒性
免疫原性	高免疫原性	低免疫原性	低免疫原性
動物模型	不能得到轉基因動物	可產生轉基因動物，效率達50以上	可以，但很難
安全係數	高	高	中
能否用於MIRCORNA	可以	可以	不可以
RNAi	病毒進入細胞往往引起細胞內干擾素反應，不適合做RNAi實驗	適合，是RNAi實驗的優選工具	可以用作RNAi實驗
基因過表達	包裝容量較大。可以滿足較大基因的包裝，是過表達基因的優選工具	包裝容量有限，過表達的基因過大時，病毒滴度受到影響	包裝容量有限，過表達的基因過大時，病毒滴度受到影響
常見套用	1、體外細胞基因轉導2、基因治療	1、體外細胞基因轉導2、基因治療	1、體外細胞基因轉導2、全基因組插入失活突變篩選3、功能基因庫構建

慢病毒

慢病毒（Lentivirus） 載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發展起來的基因治療載體。

特點：

1、區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，常用於感染難轉染的細胞，如原代細胞、神經元細胞、幹細胞、不分化細胞、心肌細胞、肝細胞、內皮細胞、腫瘤細胞，且效率近100%

2、可裝載DNA片段容量高達5kb

3、目的基因進入到宿主細胞之後，經過反轉錄，整合到基因組，形成穩定遺傳物質，使得目的基因在細胞中可穩定長期表達。

4、病毒載體顆粒通過包裝元件和含病毒基因組質粒共轉染包裝細胞系。利用逆轉錄機制構建自我失活(SIV)的HIV-1來源的載體,一旦轉移到靶細胞後,它就喪失了病毒長末端重複的轉錄能力,減少了產生重組病毒的機會,並避免了與啟動子干擾的問題。

5、比較廣泛採用的第三代包裝系統——四質粒系統只含有HIV-1共9個基因中的3個，即gag、pol、rev。由於HIV-1基因組成分中60 %被去除,因此父代病毒無法複製，是重組係數最低的一個慢病毒包裝系統，至今未見重組報導。其更安全、更穩定、更高效的技術優勢領先於市場上的三質粒及其他包裝系統。

綜上特點決定了其套用、意義：

1、用慢病毒載體攜帶目的基因比用質粒瞬時轉染更適於穩轉株構建。

2、載體帶有可進行高效率的包裝、轉染並穩定整合進靶細胞的基因組中的序列元件，其產生滴度更高，為活體動物模型實驗提供高性價比的包含目的基因的病毒液。

3、其高轉導效率及整合到基因組的特點為RNAi,cDNA 克隆以及報告基因的研究提供了一個有利的途徑。

作為快速有效的遺傳物質投遞工具，慢病毒在國內已廣泛流行，更有眾多包裝服務公司興起。同時，克服了對病毒的恐懼心理而選擇自己包裝的研究者也陸續增加。外包服務和DIY（Do It Yourself）相比，後者成本會大大降低。僅需買一個包裝試劑盒、構建一個慢病毒載體即可進行實驗。GeneCopoeia公司提供了一款基於第三代包裝系統的包裝試劑盒。試劑盒中包含除慢病毒基礎載體和包裝細胞外的其他所有成分：包裝輔助質粒混合物，滴度增強劑，慢病毒專用轉染試劑（EndoFectin Lenti），eGFP陽性對照質粒。

慢病毒包裝實驗步驟與注意事項：

1. 材料準備：包裝試劑盒、病毒質粒、細胞；（注意事項：包裝試劑盒的使用遵照說明書。檢測病毒質粒濃度，確保DNA的OD(260nm/280nm)處於1.8-2.0之間，並電泳檢測質粒是否完整。包裝實驗前準備好細胞，保證細胞狀態良好。）
   
2. 製備DNA/轉染試劑複合物：此步驟比較簡單，僅需按照試劑盒說明書操作。
   
3. 轉染工具細胞：通常使用293Ta細胞，將DNA-Endofectin Lenti複合物加入到裝有包裝細胞的培養板中。在37℃、CO₂環境下過夜培養（8-14小時），謹記培養6小時更換一次培養基，加入滴度增強劑TiterBoost，可增強滴度5-10倍。
   
4. 收穫病毒：收集轉染48小時後的培養液，500 *g離心10分鐘，去除細胞碎片雜質。接著用0.45 μm的
   聚醚碸蛋白結合過濾膜去除蛋白等雜質。收穫純度較高的病毒。
   
5. 檢測滴度。
   

腺病毒

腺病毒（adenovirus ）

腺病毒顆粒沒有包膜的直徑為70～90nm的顆粒，由252個殼粒呈二十面體排列構成。每個殼粒的直徑為7～9nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，約含35 000 bp，兩端各有長約100 bp的反向重複序列。

腺病毒的結構蛋白在細胞核內聚集形成病毒衣殼，病毒的基因組被包裝進去，形成有感染能力的病毒顆粒，並最終裂解宿主細胞被釋放出去，完成腺病毒的生活周期。

特點：

1、腺病毒具有宿主範圍非常廣，能感染增殖和非增殖各種細胞，如肝細胞、血管內皮細胞等

2、腺病毒基因組較大（36kb）絕大多數基因組均能被外源基因取代，故插入大片段外源基因的潛力大。

3、不整合到染色體中，目的基因在宿主細胞基因組外遊歷狀態下表達，無插入致突變性，對人致病性低；

4、是瞬時轉染，表達快速，容易將外源基因直接轉移到靶細胞中，有效表達成活性蛋白。

5、能自行複製，有效進行增殖，產生滴度高；

6、與人類基因同源；

7、能在同一細胞株或組織中設計表達多個基因。最簡單的方法是將含有兩個基因的雙表達盒插入腺病毒轉移載體中，或者用不同的重組病毒共轉染目的細胞株來分別表達一個蛋白。

8、銳賽生物公司腺病毒載體通過對各元件的改造，進一步降低了集體的免疫反應和細胞毒性，提高了安全性，並提高了外源基因的靶向性表達。

綜上腺病毒載體的特點，產生了其套用和意義：

1、套用於體內接種疫苗。用攜帶免疫調節基因或腫瘤特異抗原已近的腺病毒載體轉入相應腫瘤細胞以誘導抗腫瘤免疫反應，可製成具有抗腫瘤活性的瘤苗。

2、套用於信號轉導，基因轉位，Co-IP，動物實驗，幹細胞研究等科研實驗。

3、可以完成較高難度的克隆構建，包括具有細胞毒性作用基因的腺病毒構建，在短時間內完成從原始質粒到病毒DNA的構建工作。

4、產生滴度高，非常適於基因治療。例如：Rosenfeld等用構建的含肌糖原磷酸化酶cDNA的重組腺病毒感染肝細胞，糖原磷酸化酶活性增加46倍，提示可以對糖原蓄積疾病進行基因治療。

逆轉錄

逆轉錄病毒

一類含有逆轉錄酶的單鏈正鏈RNA病毒。慢病毒是逆轉錄病毒科中的亞科

原理：

逆轉錄病毒侵入宿主細胞後以自身RNA為模板，靠逆轉錄酶形成DNA環化後整合到宿主細胞的染色體中，以原病毒形式在宿主細胞中複製。

逆轉錄病毒的共同特性——

1、球形，有包膜，80~120 nm

2、基因組：單股RNA二聚體，核心有逆轉錄酶

3、複製通過DNA中間體，能與宿主細胞DNA整合

套用：

1）基因轉染和穩定表達

2）具有在基因治療和生物製藥等領域的套用潛力

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