基本介紹
- 中文名：流式細胞DNA分析
- 所屬分類：特殊檢查
正常值,臨床意義,注意事項,檢查過程,相關疾病,相關症狀,
正常值
身體處於動態平衡中，沒有疾病。
臨床意義
流式細胞儀的臨床套用： (1) 流式細胞術在腫瘤學中的套用：流式細胞術可以檢測腫瘤細胞增殖周期、檢測腫瘤細胞表面標記、癌基因表達產物、進行多藥耐藥性分析、檢測凋亡 (2) 流式細胞術在血液學中的套用：檢測白血病和淋巴瘤細胞、活化血小板、造血幹細胞(CD34+)計數、白血病與淋巴瘤的免疫分型、網織紅細胞計數、細胞移植的交叉配型和免疫狀態監測 (3) 流式細胞術在免疫學中的套用：可以進行淋巴細胞及其亞群分析、淋巴細胞免疫分型、檢測細胞因子。異常結果：有資料表示對71例胸腔積液做流式細胞DNA分析，結果顯示，對惡性胸腔積液診斷的敏感性為52%，特異性達100%。若與常規檢查聯合套用，則可使診斷的敏感性達到94%。癌性胸水細胞的DNA分析可見異倍體和S期、G2/M期細胞比例增高。 需要檢查的人群：疑似有癌性胸水等相關疾病者
注意事項
流式細胞儀並非是完全自動化的儀器，準確的實驗結果還需要準確的人工技術配合，所以標本製備需要規範，儀器本身亦需要質量控制。 (1) 流式細胞術免疫學檢測的影響因素和質量控制 流式細胞術在免疫學中有著廣泛的套用，其免疫螢光染色的標本製備非常重要，常常由於標本製備過程中出現人為非特異性螢光干擾(尤其在間接免疫螢光染色中)或細胞濃度低等影響檢測結果。解決這些影響因素的方法如下： ① 確保標本上機檢測前的濃度為1X106細胞/ml，細胞濃度過低直接影響檢測結果。 ② 使用蛋白封閉劑，封閉非特異結合位點，尤其在間接免疫螢光標記時必不可少。常用的蛋白封閉劑為0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。 ③ 螢光抗體染色後充分洗滌，注意混勻和離心速度，減少重疊細胞和細胞碎片。 ④ 設定對照樣品，採用與抗體來源同型匹配的無關對照和螢光抗體的本底對照。 ⑤ 判定結果時，應注意減去本底螢光，為使免疫螢光的定量分析更精確，套用電腦程式軟體，用擬合曲線方法從實驗組的曲線峰值中減去對照組的曲線峰值，可以得到更準確的免疫螢光定量結果。 ⑥ 注意染色後避光，保證細胞免疫螢光的穩定。 (2) DNA倍體分析的質量控制仍沒有統一的標準，各文獻報導的實驗結果差異較大，1993年10月美國癌症研究組織制定了FCMDNA 測定的統一標準，我們根據這些標準並結合國內有經驗的專家多年的實踐，對FCM的DNA分析技術的質控和注意事項進行說明。 ① 手術切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時，要避免出血壞死組織。 ② 標本採集後要及時固定或深低溫保存，以免組織發生自溶，DNA 降解，而造成測試結果的誤差。 ③ 固定劑要採用對組織細胞穿透性強的濃度，70%的乙醇固定效果較好。 ④ 單細胞懸液製備過程中，注意將待測細胞成分分離出來，減少其他成分的干擾，並注意不要損傷該群細胞。 ⑤ 細胞樣品的採集要保證足夠的細胞濃度，即1X106細胞/ml，雜質、碎片、團塊和重疊細胞應<2%，對腫瘤細胞DNA異倍體的分析樣品，至少有20%的腫瘤細胞存在。 ⑥ 石蠟包埋組織單細胞製備時要注意：取材時應選取無自溶、壞死的組織，對腫瘤組織標本，選取含腫瘤細胞豐富的區域；石蠟組織片的厚度要適宜，最好為40-50μm。過薄或過厚的切片均會影響檢測結果，徹底脫蠟，以免殘留的石蠟影響酶的消化活性，驗證脫蠟是否完全的方法是棄去二甲苯，加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，說明蠟已脫淨；水化要充分，使組織還原到與新鮮組織相似的狀態；注意消化的時間和消化酶的活性。常規使用0.5%胃蛋白酶，pH1.5。 (3) 操作方面 ① 流式細胞儀在整個工作過程中處於最佳狀態，能保證定量檢測的準確性和檢測精度。使用標準樣品調整儀器的變異係數在最小範圍，解析度在最好狀態，能避免在測量過程中儀器條件的變化引起的檢測誤差。 ② 評價儀器精度的重要指標是儀器的變異係數(CV)，對於校準樣品，其CV值越小越好，CV值越小，說明儀器校正的精度越高。校準樣品包括非生物樣品(螢光微球)和生物細胞樣品(人淋巴細胞、雞紅細胞等) 。非生物螢光微球已有商品試劑，CV一般<2%-3%。 (4) 資料分析方面 ① 當樣品中碎片雜質或團塊過多，所測細胞數在20%以下，組方圖的基線抬高時，應放棄分析處理。 ② 做細胞周期分析時，樣品細胞數應在1萬個，排除碎片、雜質和團塊，當異倍體細胞數占總細胞數10%以下時，需要結合其他診斷指標，不可盲目下結論，至少異倍體細胞占總細胞數的20%以上，可以確定異倍體的存在。 ③ DNA分析時，正常二倍體細胞組方圖CV值>8%時放棄分析，但腫瘤細胞的CV值>8%，與腫瘤細胞的異質性有關。另外，DNA倍體分析時，同源組織的不同個體會出現10%的漂移。 ④ DNA倍體標準的質量控制，採用相同個體同源正常組織、同樣固定方法、相同的樣品處理方法、相同的染色方法、同步染色、同樣的儀器檢測條件、正常的二倍體組織作為內標準。
檢查過程
流式細胞DNA分析：直接用可產生螢光的核酸染料(如碘化丙啶)對胸水中細胞進行染色，流式細胞儀分析胸水細胞的DNA含量、細胞周期分布和DNA倍體數。 流式細胞術常規檢測時的樣品製備： (1) 直接免疫螢光標記法 取一定量細胞(約1X106細胞/ml)，直接加入連線有螢光素的抗體進行免疫標記反應(如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同螢光素的抗體同時加入)，孵育20-60分鐘後，用PBS(pH7.2-7.4)洗1-2次，加入緩衝液重懸，上機檢測。本方法操作簡便，結果準確，易於分析，適用於同一細胞群多參數同時測定。雖然直標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異螢光的干擾，因此更適用於臨床標本的檢測。 (2) 間接免疫螢光標記法 取一定量的細胞懸液(約1X106細胞/ml)，先加入特異的第一抗體，待反應完全後洗去未結合抗體，再加入螢光標記的第二抗體，生成抗原-抗體-抗抗體複合物，以FCM檢測其上標記的螢光素被激發後發出的螢光。本方法費用較低，二抗套用廣泛，多用於科研標本的檢測。但由於二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性螢光背景較強，易影響實驗結果。所以標本製備時應加入陰性或陽性對照。另外，由於間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數較少的標本。
相關疾病
相關症狀
胸水，肺癌胸水，惡性胸水，血性胸水，滲出性胸水等。
