木瓜蛋白酶（Papain），又稱木瓜酶，是一種蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一種低特異性蛋白水解酶，廣泛地存在於番木瓜的根、莖、葉和果實內，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，屬於巰基蛋白酶，它具有酶活高、熱穩定性好、天然衛生安全等特點，因此在食品、醫藥、飼料、日化、皮革及紡織等行業得到廣泛套用。
基本介紹
- 中文名：木瓜蛋白酶
- 外文名：Papain
- 別稱：木瓜酶
- 性質：一種蛋白水解酶
基本信息,組成結構,化學性質,催化機制,功能特性,國內產地,生產方法,直接烘乾,噴霧乾燥,膜分離法,酶活測定,基本原理,酶活單位,試液製備,測定方法,套用範圍,食品工業,科研套用,專業術語,安全術語,風險術語,
基本信息
組成結構
番木瓜未成熟果實中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多種蛋白水解酶。且已知四種半胱氨酸蛋白酶的一級結構具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶屬巰基蛋白酶，可水解蛋白質和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端，並能優先水解那些在肽鍵的N-端具有二個羧基的胺基酸或芳香L-胺基酸的肽鍵。
木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，分子量為23406，由一種單肽鏈組成，含有212個胺基酸殘基。至少有三個胺基酸殘基存在於酶的活性中心部位，他們分別是Cys25、His159和Asp158，當Cys25被氧化劑氧化或與金屬離子結合時，酶的活力被抑制，而還原劑半胱氨酸（或亞硫酸鹽）或EDTA能恢復酶的活力。另外六個半胱氨酸殘基形成了三對二硫鍵,且都不在活性部位。純木瓜蛋白酶製品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，約占可溶性蛋白質的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，約占可溶性蛋白質的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，約占可溶性蛋白質的20%；及纖維素酶等不同的酶。
名稱 | 木瓜蛋白酶 |
別名 | 木瓜酶、番木瓜酶 |
英文名 | Papain |
法定編碼 | EC 3.4.22.2；CAS[9001-73-4] |
化學性質
木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、鹼性環境下均能分解蛋白質的蛋白酶。它的外觀為白色至淺黃色的粉末，微有吸濕性；木瓜蛋白酶溶於水和甘油，水溶液為無色或淡黃色，有時呈乳白色；幾乎不溶於乙醇、氯仿和乙醚等有機溶劑。木瓜蛋白酶是一種含巰基(-SH)肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、醯胺等有較強的水解能力，但幾乎不能分解蛋白腖。
木瓜蛋白酶的最適合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性時亦有作用，等電點（pI）為8.75；木瓜蛋白酶的最適合溫度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐熱性強，在90℃時也不會完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質激活。
木瓜蛋白酶催化機制
木瓜蛋白酶的剪下肽鍵的機制包括：在His-159作用下Cys-25去質子化，而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環的擺放，使得去質子化可以發生；然後Cys-25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳，並與之共價連線形成醯基－酶中間體；接著酶與一個水分子作用，發生去醯基化，並釋放肽鏈的羰基末端。
功能特性
《GB 2760-2011 食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規定，木瓜蛋白酶可用作食品工業在的加工助劑（酶製劑）。一般應在製成最後成品之前除去（規定有殘留量者除外）。
木瓜蛋白酶主要用於啤酒抗寒（水解啤酒中的蛋白質，避免冷藏後引起的渾濁）、肉類軟化（水解肌肉蛋白和膠原蛋白，使肉類軟化）、穀類預煮的準備、水解蛋白質和肉類香料的生產。在啤酒抗寒和肉類軟化方面的套用遠比其他蛋白酶類廣泛。用量一般為1～4mg/kg促使餅乾中麵筋的分解，以使成品鬆軟。肉類軟化有多種蛋白酶可用，比較如下表所列。
酶名稱 | 嫩化肉所需酶量/（酶單位/克肉） |
木瓜蛋白酶 | 2.5 |
鳳梨蛋白酶 | 5.0 |
無花果蛋白酶 | 5.0 |
枯草桿菌中性蛋白酶 | 75 |
米麴黴蛋白酶 | 100 |
黑麴黴蛋白酶 | 200 |
根霉蛋白酶 | 250 |
通過測定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力大小，可判斷嫩肉粉質量優劣的參考依據：把嫩肉粉溶於鹽酸半胱氨酸溶液，取該混合液與酪蛋白溶液反應10min，用紫外分光光度法測得反應所生成酪氨酸的含量。該方法具有較好的準確性和重現性。以每分鐘水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需樣品的量為1個酶活力單位。
國內產地
在中國，木瓜種植主要分布在廣西的橫縣和邕寧縣等地，屬於廣西特產水果，因此，木瓜蛋白酶生產廠家主要集中在廣西南寧市，木瓜蛋白酶的生產和研究有將近20年的時間。
木瓜產地
木瓜產地生產方法
直接烘乾
生產方法較簡單、快速，但生產出來的成品只是粗酶，雜質多、色澤差且微生物超標，酶活力也較低，只有60萬～80萬單位/g。多為個體工廠採用，已不能滿足國內食品質量衛生安全等。
噴霧乾燥
此法是先通過離心去除部分雜質後再進行噴霧乾燥，所生產出的成品酶活力相對高，達到100萬單位/g左右，雜質相對也較少，色澤相對也較白。但產品噴霧時容易粘壁，酶活損失較大，水溶性相對也較差，而且酶活穩定性也較差。
膜分離法
該生產方法不但避免了以上兩種方法的缺點，且生產過程衛生安全，收率也高，所生產的成品酶活損失小，酶活力一般可達到280萬～350萬單位/g，最高可達400萬單位/g，且酶活穩定性好，純度高，色澤潔白，細菌數低，嚴格操作可達到醫藥級別。
其提取工藝條件為超音波功率300W，超聲處理時間200s，果漿質量分數30%；經超音波強化提取，酶活力提高到原先的1.71倍；該酶在40℃以下，pH為5.4～6.0時酶活力相對穩定；EDTA、Cys和維生素C對酶活力具有激活作用，CuS04和ZnCl2具有抑制作用，而KCl、NaCI、CaCl2、MgS04對酶活力的影響不大。
木瓜蛋白酶的分離純化工藝：採用初步採集處理，20%、40%硫酸銨分級沉澱、SP-sephadexC50柱色譜、羥基磷灰石柱色譜，從番木瓜乳汁中分離純化木瓜蛋白酶。可獲得比活為1184U/mg的純酶，活力回收率為55.79%，純度達到99.31%，為高純度的木瓜蛋白酶。
酶活測定
本方法僅適用於木瓜蛋白酶。
基本原理
木瓜蛋白酶能使N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯（底物）水解而釋出N-苯甲醯-L-精氨酸，其釋出量可用氫氧化鈉液滴定，以此確定酶活力。
酶活單位
在25℃下，每分鐘內能催化分解1umol底物的酶量，稱為1單位。
試液製備
1、底物溶液：準確稱取N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽1.42g，加10mmol/LEDTA、50mmol/L半胱氨酸液2.6mL，加適量水，用0.1mol/L氫氧化鈉液調節pH至6.2，最後定容至50.0mL。
2、待測酶液：取試樣用水稀釋至適當濃度，並調節至pH6.2。
測定方法
25℃恆溫條件下，取25mL燒杯裝在pH自動滴定儀上，加底物溶液3.75mL、3mol/L氯化鈉溶液2.50mL、重蒸餾水1.25mL，混合後加入待測酶液後立即計時，用0.1mol/L氫氧化鈉在電磁攪拌下連續滴定以保持pH6.2，記下每分鐘所耗0.01mol/L氫氧化鈉毫升數。同時進行空白校正。按下式計算木瓜蛋白酶的活力P（單位/mg）：
P =C·ΔV·1000/W
式中：c：氫氧化鈉液的濃度，mol/L；ΔV：每分鐘消耗氫氧化鈉液的體積減去空白值；W：反應液中木瓜蛋白酶的質量，mg。
套用範圍
木瓜蛋白酶在醫藥、食品、飲料、化學試劑、飼料、紡織化妝品等方面都有廣泛的套用，開發前景廣闊。
食品工業
在食品行業中，木瓜蛋白酶可用於肉類嫩化、啤酒澄清、餅乾鬆化等用途。
啤酒澄清劑
木瓜蛋白酶在啤酒中的套用
木瓜蛋白酶在啤酒中的套用引起啤酒冷藏混濁時主要原因是啤酒中的蛋白質極易與多元酚結合成大分子的複合物。利用啤酒澄清劑中的木瓜蛋白酶對形成混濁的蛋白質有廣泛的特異性，能把大分子的蛋白質降解成小分子的物質，提高了蛋白質與多元酚複合物的溶解度；另一方面，木瓜蛋白酶是一種具有生物活性的蛋白質，該蛋白質可與引起啤酒冷藏混濁的多元酚形成穩定狀態平衡，防止了啤酒的冷藏混濁。
肉類嫩化劑
利用木瓜蛋白酶能裂解肉類中的膠原蛋白和肌肉纖維，而使肉的結構鬆散。由於木瓜蛋白酶是半胱氨醯基蛋白酶，能降解膠原纖維和結締組織蛋白質，它將肌動球蛋白和膠原蛋白降解成為小分子的多肽甚至胺基酸, 令肌肉肌絲和筋腰絲斷裂, 使肉類變得嫩滑，並簡化蛋白質結構使人體食用後易於消化吸收。
餅乾鬆化劑
利用木瓜蛋白酶的酶促反應, 將麵團的蛋白質降解為小分子的膚或氨基酶, 降低了麵團的拉伸阻力, 使麵團變得柔軟、更有可塑性, 減少彈性, 易於成型。用量視餅乾廠的加工方法和麵團中蛋白質的含量不同而不同，研究表明每公斤面添加0.6-1.0萬單位/ 克為佳。
木瓜蛋白酶在餅乾中的套用科研套用
木瓜蛋白酶可用於細胞培養實驗，在準備細胞培養液（cellculture）的第一步中被用於分離細胞。用酶處理小組織塊10分鐘後，就可以將連線細胞的細胞外基質打斷；然後再用蛋白酶抑制劑來停止反應，防止木瓜蛋白酶進一步裂解細胞本身；最後用Pasteurpipette將組織塊打散為單細胞懸浮液。
在免疫學中，木瓜蛋白酶可被用於將免疫球蛋白（即抗體）的Fc片段（可結晶）和Fab片段（抗原結合）切割開。
專業術語
安全術語
S22 Do not breathe dust.
切勿吸入粉塵。
S24 Avoid contact with skin.
避免皮膚接觸。
S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
不慎與眼睛接觸後，請立即用大量清水沖洗並徵求醫生意見。
S36/37 Wear suitable protective clothing and gloves.
穿戴適當的防護服和手套。
風險術語
R36/37/38 Irritating to eyes, respiratory system and skin.
刺激眼睛、呼吸系統和皮膚。
R42 May cause sensitization by inhalation.
吸入可能致敏。
