採用逆代謝工程策略的抗生素高產菌株分子育種研究

《採用逆代謝工程策略的抗生素高產菌株分子育種研究》是依託浙大寧波理工學院，由金志華擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：採用逆代謝工程策略的抗生素高產菌株分子育種研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：金志華
• 依託單位：浙大寧波理工學院

項目摘要

研究擬採用逆代謝工程策略，通過抗生素高產相關基因的篩選、功能分析確定決定抗生素高產表型的關鍵基因，結合相關篩選方法對這些關鍵基因等進行定向進化，實現抗生素產生菌的定向育種，以期高效提升抗生素產量。擬在前期大量研究的基礎上，構建普那黴素產生菌的基因組DNA文庫，從中獲取前期工作所篩選出的普那黴素高產相關基因的全長DNA序列，並進行全面的基因結構和功能分析，明晰基因對表型的主控關係，確定決定普那黴素產量增加的關鍵基因；最後定向進化目標高產關鍵基因對始旋鏈黴菌進行遺傳改造進而提高普那黴素產量。通過本項目研究，將明晰普那黴素高產的分子機理，建立將逆代謝工程策略和定向進化相結合的抗生素高產菌株分子育種新體系，為抗生素高產菌株的選育提供新的理論和技術支持，從而快速、高效地篩選出具有產業化價值的高產菌株。研究對提高微生物代謝產物的發酵水平、促進工業生物技術的快速發展具有重要的科學意義和廣闊的套用前景。

結題摘要

本項目採用逆代謝工程研究策略對始旋鏈黴菌進行普那黴素高產相關基因的挖掘、功能分析、DNA改組和發酵工藝等研究。通過構建旋鏈黴菌基因組DNA文庫篩選出5個普那黴素生物合成相關的新基因，進一步基因功能研究發現，編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶的spy1基因可差異調控普那黴素兩種組分的生物合成，其餘四個基因與普那黴素生物合成呈正相關。對普那黴素高產菌株spy1基因的生物信息學分析發現其核酸序列發生突變，酶催化亞基3處二級結構域發生改變，初步闡明基因調控普那黴素高產機理。利用基因轉錄豐度篩選出了3個普那黴素高產關鍵基因；對高產關鍵基因ptr進行DNA改組研究，篩選獲得一株普那黴素高產菌株sps16，其產量為0.12 g/L，為出發菌株的6倍；進一步序列分析表明，ptr改組基因主要發生了點突變，其中C端突變增加了螺旋的數量，初步了解了DNA改組菌株高產的分子機理。研究了培養基關鍵組分對普那黴素生物合成的調控機理，發現高濃度的葡萄糖、磷酸鹽及銨離子可抑制普那黴素的合成。最後利用普那黴素高產菌株進行了普那黴素發酵工藝研究，發現添加乳化的正十六烷氧載體，普那黴素產量可達0.18g/L，提高了3.1倍；還發現添加甘氨酸前體並耦合樹脂進行原位分離，普那黴素的最高產量可達到0.62 g/L，為對照的4.3倍。