《枯草芽孢桿菌合成核黃素的基因組工程研究》是依託天津大學，由王智文擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：枯草芽孢桿菌合成核黃素的基因組工程研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王智文
- 依託單位：天津大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
基因組工程是實現菌種目標性能最佳化，探討優良性狀遺傳調控基礎，開發或發展控制生物設計法則的重要技術。本項目擬針對如何在基因組尺度最佳化不同途徑基因的協調錶達以提高核黃素合成能力的關鍵科學問題，以基因組簡化的枯草芽孢桿菌為底盤，通過多元模組工程策略，基因組工程最佳化核黃素合成的代謝網路。首先根據基因組簡化信息重構基因組尺度代謝網路模型，模擬預測修飾的靶位點；同時，建立和最佳化成簇的規律間隔的短回文重複序列關聯蛋白（CRISP/Cas9）介導的基因組編輯系統，為基因組工程奠定技術基礎；採用多元模組工程的策略，利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術，基因組上最佳化不同途徑模組間和模組內基因協調錶達，解調和最佳化細胞的代謝調控網路，提高核黃素合成能力，探討核黃素高產的遺傳調控機理。本項目的成功實施將加深對枯草芽孢桿菌產核黃素遺傳調控機理的認識，為基因組簡化的底盤細胞生產生物基產品的基因組工程提供理論指導。
結題摘要
基因組工程是通過先進的基因組編輯手段，實現菌種目標性能最佳化，探討優良性狀遺傳調控基礎，開發或發展生物的設計法則。本項目針對如何在基因組尺度最佳化不同途徑基因的協調錶達以提高核黃素合成能力的關鍵科學問題，以野生型枯草芽孢桿菌為底盤，構建先進的基因組編輯技術和合成生物學調控元件，通過多元模組工程策略，基因組尺度最佳化核黃素合成的代謝網路，取得了系列重要結果。構建枯草芽孢桿菌基於CRISPR/Cas9n的基因組多位點編輯系統，通過胞內單鏈DNA切口修復系統ligD基因修飾和系統最佳化，基因組三位點同時編輯效率達65%，實現3天一個循環的高效基因組編輯，達到目前枯草芽孢桿菌報導的最高多位點基因編輯效率。基於野生型枯草芽孢桿菌168轉錄組數據分析，首次設計構建枯草芽孢桿菌人工合成啟動子文庫，文庫強度調控範圍廣，且構建的強啟動子是P43啟動子的2.77倍。啟動子強度在轉錄和翻譯水平具有很好的相關性，基於發現的“位點-鹼基”分布規律的啟動子理性重構方法，重構強啟動子和啟動子文庫，強化了基因表達精準調控能力。修正和改進枯草芽孢桿菌基因組尺度代謝網路模型iBsu1147質量，基於通量平衡分析（FBA）算法，獲得枯草芽孢桿菌中核黃素最優合成途徑及其通量分布。利用開發的通量可變性分析（FVA），成功預測了基因擾動靶點，理性指導核黃素高產菌株的構建。利用多元模組代謝工程策略，最佳化核黃素合成的嘌呤代謝途徑模組、核黃素操縱子模組、戊糖磷酸途徑模組和呼吸鏈模組，使野生型菌株核黃素產量達4.3 g/L。結合基因組重排技術，構建的核黃素高產菌株B. subtilis 1-1產量達18.5 g/L，核黃素得率0.119 g/g 葡萄糖。結合轉錄組分析和代謝物組分析等系統生物學手段，探討了不同途徑基因的協調錶達導致核黃素高產的遺傳調控機理，加深了枯草芽孢桿菌高產核黃素遺傳調控機理的認識，為枯草芽孢桿菌高效合成其他生物基產品提供理論和技術指導。
