《腐霉（Pythium）高產EPA代謝調控機理研究》是依託華中科技大學，由余龍江擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：腐霉(Pythium)高產EPA代謝調控機理研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：余龍江
- 依託單位：華中科技大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等多不飽和脂肪酸(PuFAs)具有重要生理功能，市場供不應求，微生物發酵是生產PuFAs首選途徑，AA、DHA已實現產業化，但EPA產量較低，離產業化尚有距離。本課題組獲得了一株EPA產量高於目前國內外報導最高水平的腐黴菌株，該菌株具有油酸、亞油酸含量較高等特點，若將油酸和亞油酸轉化為EPA，可實現EPA高產腐霉發酵。本課題擬通過EPA合成途徑關鍵酶基因克隆、強啟動子及多拷貝的多價載體構建、農桿菌介導絲狀真菌轉化、基因表達Q-PCR監測、脂肪酸代謝組GC-MS分析等技術集成，闡明腐霉EPA合成途徑限速步驟和影響關鍵酶的各種因素，揭示腐霉高產EPA代謝調控機理，建立EPA高產發酵調控策略，為利用代謝工程方法構建EPA高產菌株並實施EPA高效發酵代謝調控打下堅實基礎，也為其他EPA菌株高產發酵以及絲狀真菌代謝調控研究提供參考。
結題摘要
本課題前期建立了產EPA真菌的高通量篩選方法，篩選獲得了較高產量的EPA菌株，通過菌種鑑定，確定其為華麗腐霉（Pythium splendens）。 通過研究影響該菌株EPA合成的各種因素，發現溫度、溶解氧及油脂合成代謝調節劑等因素對EPA合成影響較大，結合GC-MS分析脂肪酸組成，揭示了該菌株EPA合成途徑，發現n-6途徑是其主途徑，n-3途徑是次要途徑，且首次發現還存在特殊途徑，即“∆8脫氫”途徑，它是n-6途徑中補充途徑。同時，還發現其n-3途徑與已報導的不同，具有特有的成分20:3Δ11,14,17及∆8脫氫酶。採用直接添加外源脂肪酸底物對所確定的EPA合成途徑進行分析，進一步發現EPA合成途徑限速步驟及其關鍵酶為Δ12、Δ6及Δ17脫氫酶，從而揭示了該菌株中油酸、亞油酸含量較高且含有較多花生四烯酸（AA）的原因，通過關鍵酶基因克隆、功能驗證、QRT- PCR檢測及表達譜分析，進一步確證了以上限速步驟及其關鍵酶。 分別從華麗腐霉和高山被孢霉cDNA中克隆了Δ17和Δ12脫氫酶基因，Δ6脫氫酶基因通過轉錄組測序結果克隆得到。通過生物信息學軟體分析，Δ12和Δ17脫氫酶基因分別與已報導的同源性高達99%、99.8%，而Δ6脫氫酶基因與已報導的同源性僅為86%，確定為新基因，並通過轉入酵母表達進行了功能驗證；還發現Δ6和Δ17脫氫酶基因均存在3個組氨酸保守區HXXXH、HXXHH和Q/HXHH，且Δ6脫氫酶基因的胺基酸序列含有一個細胞色素b5結構域。 建立並最佳化了農桿菌介導華麗腐霉遺傳轉化體系，同時建立了基因槍法轉化華麗腐霉的條件。構建了含構巢麴黴強啟動子Trpc的Δ6、Δ12和Δ17脫氫酶基因的pCAMBIA1303單價表達載體及Δ6、Δ5脫氫酶和E6延長酶三價表達載體，轉化華麗腐霉結果表明，基因拷貝數增加可促進底物油酸、亞油酸及AA等中間產物轉化，從而增加EPA積累；構建了雙拷貝Δ6脫氫酶基因的pAO815酵母表達載體，轉化酵母結果表明，雙拷貝較單拷貝增加了Δ6脫氫酶表達，促進了亞油酸轉化。 本課題完成了計畫任務，到達了預期目標。確定了華麗腐霉EPA合成途徑及其限速步驟對應的關鍵酶；揭示了高產EPA合成調控機理，為EPA高產菌構建提供了理論和實驗依據。
