巨噬細胞(血液細胞):生命周期,培養方法,培養環境,分離方法,抑制因子,損傷時間,

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便於培養，並可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長期生存。

巨噬細胞（英語：Macrophages，縮寫為mø[1]）是一種位於組織內的白血球，源自單核細胞，而單核細胞又來源於骨髓中的前體細胞。巨噬細胞和單核細胞皆為吞噬細胞，在脊椎動物體內參與非特異性防衛（先天性免疫）和特異性防衛（細胞免疫）。它們的主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行噬菌作用（即吞噬以及消化），並激活淋巴球或其他免疫細胞，令其對病原體作出反應。

基本介紹

中文名：巨噬細胞
外文名：Macrophages
縮寫：mø
類型：免疫細胞

生命周期,培養方法,培養環境,分離方法,抑制因子,損傷時間,推斷方法,分子機制,

生命周期

當單核細胞經血管的內皮細胞層進入一已受損的組織時（這過程被稱為白血球外滲作用），它經過一連串轉變以成為巨噬細胞。單核細胞會因化學趨向性而被化學物質的刺激吸引至受損處，這些刺激包括受傷細胞、病原體、由肥大細胞和嗜鹼性細胞所釋放的組織胺，以及由已於該處的巨噬細胞釋出的細胞因子。在某些地方，如睪丸，巨噬細胞已被證實會透過增殖以移殖於此。

與壽命較短的中性粒細胞不同，其壽命可達數個月至數年不等。[2]

培養方法

巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態和吞噬功能，易於傳代和瓶壁分離，但難以建株。培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用，其法如下：

1、實驗前三天，向每隻小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯1ml（勿注入腸內）。

2、引頸殺死動物，手提鼠尾將全鼠浸入70%酒精中3～5秒。

3、置動物於解剖台上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

4、再用70%酒精擦洗腹膜壁後，用注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動。

5、用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集於針頭下吸取入針管內。

6、小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250g4℃離心10分鐘，去上清，加10mlEagle培養基。

7、計數細胞，每隻小鼠可產生20～30×105細胞，其中90%為巨噬細胞。

8、為獲取3×105帖附細胞/平方厘米，需接種2.5×106/ml。

9、為純化培養細胞，去除其它白細胞，接種數小時後，去除培養液，用Eagle液沖洗1～2次後，再加新Eagle培養液置37℃，5%CO₂溫箱中培養。

培養環境

細胞培養是無菌操作技術，要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環境清潔，空氣清新，乾燥和無煙塵。細胞培養室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側，常規操作和封閉培養於一室，而洗刷消毒在另一室。

常用設施及設備

超淨工作檯：也稱淨化工作檯，側流式，直流式和外流式三大類。
無菌操作間：一般由衣間，緩衝間和操作間三部分組成。操作間放置淨化工作檯及二氧化碳培養箱，離心機，倒置顯微鏡等。緩衝間可放置電冰櫃，冷藏器及消毒好的無菌物品等。
操作間：普通培養箱，離心機，水浴鍋，定時鐘，普通天平及日常分析處理物
洗刷消毒間：烤箱，消毒鍋，蒸餾水處理器及酸缸等。
分析間：顯微鏡，計算機及列印等。

培養器皿

常用細胞培養器皿有培養瓶，培養板，培養皿等。常準備量是使用量的三倍。器皿應選擇透明度好，無毒，利於細胞粘附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料製品或中性硬度玻璃製品。常用的器皿有下面幾種。

(1)液體儲存瓶：用於儲存各種配製好的培養液，血清等液體，常用規格有500ml，250ml，100ml等幾種。

(2)培養瓶：根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異，用於細胞傳代培養的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便於細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小於1cm，允許吸管伸入瓶內任何部位，規格有200ml，100ml，50ml，25ml，10ml等幾種。

(3)培養皿：用於開放式培養及其它用途。分直徑30mm，60mm，120mm等幾種。

(4)吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良後管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用於移動液體。常用1ml和10ml兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。

(5)離心管：離心管是細胞培養中使用最廣泛的器皿，根據用途不同形態各樣，常用於細胞培養的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml，30ml，15ml；後者則多為10ml和5ml。

(6)其它：如三角燒瓶，燒杯，量筒，漏斗，注射器等。

細胞培養溫度

維持培養細胞旺盛生長，必須有恆定而適宜的溫度。不同種類的細胞對培養溫度要求也不同。人體細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離一溫度範圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。

培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復；在40-41℃1小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數有可能恢復；41-42℃1小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，但細胞仍有恢復可能;當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡。

相反，溫度不低於0℃時，對細胞代謝雖有影響，但並無傷害作用;把細胞放入25-35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度減慢；放在4℃數小時後，再回到37℃培養，細胞仍能繼續生長。細胞代謝隨溫度降低而減慢。當溫度降至冰點以下時，細胞可因胞質結冰受損而死亡。但是，如果向培養液中加入一定量的冷凍保護劑(二甲亞碸或甘油)，可在深低溫下如-80℃或-196℃(液氮)長期保存。

合適的氣體環境

氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養時一般把細胞置於95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養中的主要作用在於維持培養基的pH值。數細胞的適宜pH為7.2-7.4，偏離這一範圍對細胞培養將產生有害的影響。但細胞耐酸性比耐鹼性大一些，在偏酸環境中更利於細胞生長。但有一些細胞也喜歡偏鹼環境中生長，如成纖維細胞最適合pH是7.4-7.6。每種細胞都有其最適pH值。

分離方法

腹腔中分離

1、取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛並消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）無菌的液體石蠟或巰基乙酸肉湯或4%澱粉肉湯。3～4天以後收集腹腔細胞。

2、如要收集腹腔靜置巨噬細胞，不注射刺激物，直接從一步開始。放血處死動物，以減少腹腔中的紅細胞。消毒腹部，沿腹中線注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中預冷的無菌PBS-H（含10U/ml肝素和10%小牛血清的PBS）。輕輕按摩腹部5分鐘。

3、以下均無菌操作。剪開腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣容量的預冷PBS-H沖洗腹腔2～3次。合併滲出液於離心管中，4℃離心250×g10分鐘，去上清液。

4、用預冷的RPMI-1640培養液洗滌細胞3次，每次4℃離心250×g10分鐘，去上清液。用預冷的適量RPMI-1640培養液懸浮細胞，台盼藍染色計數細胞並決定細胞活力。

家兔肺泡巨噬細胞的分離和純化

巨噬細胞的分離和純化

1、取2～3公斤重的家兔，耳緣靜脈注射10ml空氣處死動物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉動物。仰臥固定，消毒胸部，剪開胸壁。以下過程注意無菌操作。小心從環狀軟骨下方剪下氣管，分離心臟和血管，取出肺，剪去脂肪和結締組織。用無菌紗布小心擦淨肺表面，稱重。

2、分離肺泡巨噬細胞：用夾子夾住氣管，使肺懸空。向氣管中注射40ml無菌的冷生理鹽水，讓生理鹽水進入全部肺泡。用鑷子提起氣管，從夾子下面剪斷氣管，將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法，用40ml無菌冷生理鹽水沖洗肺泡，合併浸出液，置4℃。

3、分離肺組織中的巨噬細胞：取出肺泡巨噬細胞後，剪去氣管，將肺組織放在有冷RPMI-1640培養液的平皿中。平皿置冰上，用吸滿冷RPMI-1640培養液的20ml注射器接23號針頭，一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織，直到肺組織與支氣管樹全部分離。使肺組織通過00目的鋼絲網，分離單細胞。

4、以下過程均在4℃中進行。分別處移動圖片理肺泡巨噬細胞和肺組織中的巨噬細胞：離心200×g10分鐘，去上清液。輕彈試管，懸浮細胞，加入10ml低滲液（20mmol/LTris,0.75%氯化銨，pH7.4），37℃處理3～5分鐘，溶解紅細胞。紅細胞通常分別占肺泡巨噬細胞和組織巨噬細胞的1%和10%。也可以不用低滲處理，直接在淋巴細胞分離液上分離巨噬細胞。

5、離心200×g10分鐘，去上清液。用RPMI-1640培養液洗滌細胞一次。將細胞懸液加在淋巴細胞分離液（比重1.077）上，離心400×g20分鐘，收集交界面的巨噬細胞。棄去沉澱的死細胞和紅細胞。

6、用RPMI-1640培養液洗滌巨噬細胞2次。台盼藍染色檢測細胞活力和細胞數，將細胞配成所需濃度。此時巨噬細胞活力可達90%以上，巨噬細胞占全部細胞的90%以上。

抑制因子

巨噬細胞遊走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是集細胞因子、生長因子、激素和酶特性於一身的多效能蛋白分子。MIF高度保守，在多種急慢性炎症性疾病中發揮多種免疫功能。

MIF參與動脈粥樣硬化發病和發展，即斑塊形成、動脈損傷後重建、動脈瘤形成、心肌梗死、缺血再灌注損傷等機制。此外，其他形式的心肌功能不全和炎症與MIF參與血管再生有關。從特徵和功能方面，MIF顯著不同於其他細胞因子，是提高動脈粥樣硬化治療的最主要的靶向。

利用MIF，作為心血管疾病治療靶向和診斷標誌物。第四軍醫大學西京醫院呼吸內科、西安市中心醫院和陝西省綏德縣醫院的研究人員共同完成的研究發現，白藜蘆醇可以抑制肺泡巨噬細胞過度釋放腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6），為慢性氣道炎症的治療帶來了新的希望。

在呼吸系統疾病中，氣道炎症的慢性化以及氣道的重塑是多種肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等的共同病理生理特徵，該特徵是由多種炎症細胞及細胞因子相互作用所致的氣道病變。在病理生理過程中巨噬細胞起著極為重要的作用，巨噬細胞在細菌產物、煙霧等有害成分如甲醛、NO2及其他一些氧化產物刺激下，向肺組織遷移並釋放多種細胞因子如TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1等，反過來這些細胞因子又可趨化中性粒細胞、T細胞、嗜酸性粒細胞等向肺組織遷移，這些細胞和炎性細胞因子是引起氣道炎症慢性化和氣道嚴重損傷的重要因素。如果能有效地抑制細胞和炎症細胞因子的釋放，

就會降低及減輕氣道的損傷。為探討白藜蘆醇（Res）對小鼠肺泡巨噬細胞釋放細胞因子IL-6、TNF-α的影響，研究人員經從小鼠支氣管肺泡灌洗中獲得肺泡巨噬細胞，分5組進行培養，各組在培養4、6、12、24小時提取上清液，套用ELISA法測定上清液中IL-6、TNF-α含量。

在LPS刺激下IL-6於12小時達釋放高峰，在高峰期隨著白藜蘆醇濃度的逐步加大，IL-6的含量相應逐漸降低，E組IL-6含量明顯低於只有內毒素刺激的A組（P<0.05）。同樣在LPS刺激下TNF-α於6小時達釋放高峰，在高峰期隨著白藜蘆醇濃度的逐步加大，TNF-α含量也相應逐漸降低，而C組、D組、E組TNF-α含量明顯低於A組（P<0.05）。白藜蘆醇對小鼠肺泡巨噬細胞過度釋放炎症細胞因子IL-6、TNF-α具有明顯抑制作用，這為氣道慢性炎症的治療提供了理論依據。

損傷時間

在機體創傷修復過程中，巨噬細胞主要有兩方面的作用。

其一，一旦機體創傷活動開始,巨噬細胞就能大量分泌多種生物活性物質以及多種酶類物質，其中生物活性物質又稱巨噬細胞源性生物因子，包括多肽轉換生長因子、白細胞介素、腫瘤壞死因子、血小板衍生生長因子以及一氧化氮等；酶類物質主要包括膠原酶、彈性蛋白酶、纖溶酶原激活劑等；這些生物活性物質直接引導著機體修復的整體進程。

其二，巨噬細胞作為炎症階段的主要吞噬細胞，負責清除機體損傷處組織和細胞的壞死碎片以及病原體等，這些物質對創傷癒合過程都有重要的調控作用。因此，研究創傷修復過程中巨噬細胞釋放的細胞因子的種類和含量在創傷後不同時間的變化規律，將可能從分子水平和細胞水平上提供一些與損傷時間相關的標誌性變化或依據；而文獻報導巨噬細胞吞噬物的變化亦具有與時間相關的特點，巨噬細胞吞噬物在形態上易於觀察和檢測，這些特徵使得巨噬細胞在損傷時間推斷過程中具有重要的法醫學意義。

巨噬細胞源性細胞因子與損傷時間的關係

創傷修復是一個在時間和空間上受一定的細胞生物因子所調控的複雜生物學過程，

中巨噬細胞分泌的細胞因子在創傷修復中的活躍表達近年來已被中外學者所關注，一些已考慮作為損傷時間推斷的有用參數其。認為主要參與損傷修復的巨噬細胞源性細胞因子有以下幾種。

轉化生長因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）TGF-β是具有廣泛生物學效應的多肽細胞因子，來源於血小板、巨噬細胞、T淋巴細胞、增殖的上皮細胞、成纖維細胞等，參與細胞的增殖分化、代謝和內外間質的形成，在組織創傷、修復、炎症、骨質再生、腫瘤發生等病理生理過程中起重要作用；TGF-β還是一種極強的免疫調節劑，能抑制多種免疫反應，對單核巨噬細胞等炎性細胞具有極強的趨化性。TGF-β通過調節細胞周期因子、轉錄因子、生長因子、粘附分子和細胞基質基因的啟動、轉錄、降解等環節而實現其促進或抑制細胞生長的功能創緣組織表達。

TGF-β能誘導中性粒細胞和巨噬細胞向創傷部位補充，促進成纖維細胞增殖和細胞基質的合成，並能促進表皮細胞的增殖。TGF-β是再生上皮化的重要標誌，是皮膚基質和肉芽組織形成的重要且必不可少的條件，已證實它能影響癒合過程的各個階段，提供正常癒合的信號物質，其中TGF-β與創傷關係最為密切。此外，TGF-β還促進成纖維細胞趨化，產生膠原和纖維連線蛋白，抑制膠原降解，促進纖維化發生。謝舉臨等認為TGF-β是創傷修復過程中促進切創癒合的一類強有力的細胞因子，它的表達異常直接影響傷口癒合的時間。

活體組織受損後，局部可發生出血、壞死，巨噬細胞吞噬組織間隙的血細胞和壞死組織後，吞噬物與胞漿內的溶酶體融合，隨損傷時間的延長而逐漸降解，不能分解的物質則在胞漿內形成殘留物。BetzP表明，含吞噬物的巨噬細胞如噬脂細胞、噬血紅蛋白細胞和噬鐵細胞最早在傷後2～3天出現，損傷組織中出現吞噬細胞的時間有部位差別。在人體，腦和皮膚組織出現噬鐵細胞的時間於出血後15～17h，而在肺則出現在出血後30min左右。

組織內出血時，從血管中逸出的紅細胞被巨噬細胞攝入並由其溶酶體降解，使來自紅細胞的血紅蛋白的Fe3+與蛋白質合成電鏡下可見的鐵蛋白微粒，若干鐵蛋白微粒聚集成為光鏡下可見的棕黃色，較粗大的折光顆粒稱為含鐵血黃素。

推斷方法

巨噬細胞破裂後，此色素也可見於細胞外。含鐵血黃素因含Fe3+而被普魯氏藍染成藍色。LaihoK報導，在人體，損傷出血後21～48h皮膚和皮下出現噬鐵細胞，4～8天后則多。BetzP等通過研究人體皮膚損傷標本認為，含鐵血黃素最早於傷後3天檢測到，傷後8天則超過顯微鏡20%的區域均可見含鐵血黃素沉積。據此認為只要20%或以上的檢測區域檢見含鐵血黃素沉積，就可認定損傷時間大約為7天。因此，通過圖像分析系統檢測巨噬細胞吞噬物推斷損傷時間有可能成為一種非常簡便易行的方法。

分子機制

巨噬細胞（Macrophages）能夠吞沒、破壞受損傷組織，有助於啟動康復過程。雖然它們在損傷位點發揮關鍵作用，但一旦任務完成，就需要儘快撤離，結束炎症反應，為再生過程開路。繼續存在的巨噬細胞不利於組織恢復。儘管研究人員對於啟動巨噬細胞的分子機制研究的比較透徹，但關於其退出損傷位點的過程還了解甚少。研究人員鑑別出一清除外周神經損傷位點巨噬細胞的關鍵環節，對弄清脊髓損傷、中風和多發性硬化中相似的分子機制提供了重要線索。已知Nogo細胞受體家族與神經細胞生長有關，SamuelDavid等觀測Nogo家族成員NgR1的作用。NgR1類受體是位於細胞膜上的蛋白開關，受到特異化學信號或配體刺激後，誘導細胞反應。

破壞大鼠、小鼠的大腿坐骨神經，觀察NgR1在修復過程中的作用，結果發現巨噬細胞到達損傷位點後，細胞表面會表達NgR1。進一步研究發現，受損神經合成髓磷脂時，NgR1不僅阻止巨噬細胞與髓磷脂結合，而且直接排斥正在形成過程中的髓磷脂，若抑制髓磷脂再生，巨噬細胞會停留在損傷位點周圍。最終，研究人員在髓磷脂上鑑別出特異激發排斥反應的分子。可套用於外周神經以外的神經（中樞神經），他們發現中風、多發性硬化和脊髓損傷過程中激活的巨噬細胞，表面都會表達NgR1。

巨噬細胞分型

巨噬細胞作為一種具有可塑性和多能性的細胞群體,在體內外不同的微環境影響下,表現出明顯的功能差異。目前根據活化狀態和發揮功能的不同,巨噬細胞主要可分為M1型即經典活化的巨噬細胞(classicallyactivatedmacrophage),和M2型即替代性活化的巨噬細胞(alternativelyactivatedmacrophage)。

巨噬細胞是一種極具異質性的細胞群體,在體內複雜的微環境中,表現出獨特的表型和功能。Mantovani等認為巨噬細胞存在一系列連續的功能狀態,而M1型和M2型巨噬細胞是這一連續狀態兩個極端。M1型巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子,並專職提呈抗原,參與正向免疫應答,發揮免疫監視的功能;M2型巨噬細胞僅有較弱抗原提呈能力,並通過分泌抑制性細胞因子IL-10和/或TGF-B等下調免疫應答,在免疫調節中發揮重要作用。通過表型鑑定巨噬細胞的類型,在研究巨噬細胞在不同生理和病理條件下所發揮的功能具有重要的意義。然而,至今仍沒有公認的表型標誌來鑑定和區分不同類型的巨噬細胞,M1型和M2型巨噬細胞的表型特徵尚無定論。

巨噬細胞(血液細胞)