完全基因敲除

基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。

完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性。

基本介紹

• 中文名：完全基因敲除
• 定義：指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性

實驗中一般採用取代型或插入型載體在ES細胞中根據正-負雙向選擇（positive-negative selection，PNS）原理進行完全基因敲除實驗。正向選擇基因neo通常被插入載體靶DNA功能最關鍵的外顯子中，或通過同源重組法置換靶基因的功能區。neo基因有雙重作用，一方面形成靶位點的插入突變，同時可作為正向篩選標記。負向選擇基因HSV-tk（human semian virus-thymidinekinase）則被置於目的片段外側，含有該基因的重組細胞不能在選擇培養基上生長。如果細胞中發生了隨機重組，負向選擇基因就可能被整合到基因組中，導致細胞死亡。由於基因轉移的同源重組自然發生率極低，動物的重組機率為10～10，植物的機率為10～10，即使採用雙向選擇法也很難保證一次就從眾多細胞中篩選出真正發生了同源重組的胚胎幹細胞，必須用PCR及Southern雜交等多種分子篩選技術驗證確實獲得了目的基因被敲除的細胞系。